Генно-модифицированные организмы — незаменимый инструмент для исследования функций генов и некодирующих последовательностей, взаимодействия регуляторных последовательностей в геноме и экспрессии рекомбинантных белков, а также для моделирования заболеваний человека. До недавнего времени получение генно-модифицированных животных являлось очень длительным и дорогостоящим и потому практически недоступным для многих групп ученых, однако все изменилось с появлением новых систем редактирования генома. В 2013 г. была опубликована первая статья о применении системы CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated nuclease 9) — методики, позволяющей в один прием инактивировать несколько генов [1]. Система включает РНК, содержащую регулярные кластеры коротких палиндромных повторов (CRISPR), транс-активирующую РНК и белок Cas9 (нуклеазу). Этот комплекс, который в природе выполняет роль иммунитета бактерий против паразитирующих на них фагов [2], был приспособлен для редактирования ДНК как in vitro, так и в клетках млекопитающих [3]. Белок Cas9 эффективно вносит двуцепочечный разрыв в трех нуклеотидах от PAM-сайта (protospacer adjacent motif) — NGG, который расположен сразу за последовательностью, комплементарной РНК-гиду длиной 19 нуклеотидов [4]. На место разрыва клеточная система репарации генома вносит короткие делеции или вставки. При одновременном добавлении конструкций, содержащих последовательности, гомологичные области вокруг разрыва, происходит гомологичная репарация и возможна вставка желаемого фрагмента в геном по определенному сайту [5]. Данный подход используется для вставки экспрессионной кассеты по месту внесения разрыва (knock-in). Открытие системы редактирования генома CRISPR/Cas9 произвело настоящую революцию в получении генно-модифицированных животных, сократив продолжительность экспериментов с нескольких лет до нескольких месяцев. С помощью микроинъекций в пронуклеус зиготы комплекса РНК-гида с белком Сas9 уже были получены генно-модифицированные мыши [6, 7], крысы [7], обезьяны [8] и др.

Система CRISPR/Cas9 была неоднократно успешно применена для моделирования заболеваний человека на мышах [9, 10, 11]. При создании таких моделей важно провести модификацию в строго определенном сайте, не нарушив работу остальных генов. Проблема неспецифической модификации очень актуальна, и, несмотря на существование множества биоинформатических программ, позволяющих подбирать РНК-гиды к заданным сайтам и оценивать их эффективность и специфичность, остается вероятность внесения нежелательных мутаций по нецелевым (off target, OT) сайтам [6]. Предсказанные OT-сайты, как правило, анализируют на наличие мутаций и делают это уже после рождения трансгенного потомства, т. е. минимум через три недели после проведения микроинъекций, в то время как анализ на стадии бластоцисты позволил бы оценить специфичность вносимых модификаций заранее. Однако методы, чаще всего используемые для амплификации ДНК предимплантационных эмбрионов, не позволяют проанализировать несколько участков генома [12]. Сейчас для анализа нескольких сайтов в геноме мышиных эмбрионов применяют полногеномную амплификацию перед постановкой полимеразной цепной реакции (ПЦР) или проводят два раунда ПЦР [13]. Такой подход приводит к появлению как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов ввиду низкого содержания ДНК в исходном образце [14], а высокая стоимость реактивов для полногеномной амплификации вынуждает исследователей анализировать меньшее число эмбрионов.

В статье мы описываем метод приготовления тотальной ДНК из одного эмбриона мыши на стадии бластоцисты, который упрощает, ускоряет и удешевляет процесс получения генно-модифицированных животных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

На первом этапе исследования оценивали эффективность нескольких методов лизиса бластоцист. Эксперименты проводили в трех повторностях с момента получения оплодотворенных яйцеклеток, при этом для каждого метода использовали не менее 20 бластоцист. Параллельно изучали влияние метода подготовки бластоцист к лизису и определяли минимальное количество лизата для амплификации (три эксперимента). Затем проводили эксперименты по анализу эффективности редактирования генома комплексом CRISPR/Cas9 (детекция коротких вставок и делеций, выявление целевой вставки в геном) с использованием метода лизиса, показавшего в предыдущих экспериментах лучший результат. РНК-гиды подбирали для интронов 8 и 34 гена дистрофина (DMD), мутации в котором вызывают развитие миодистрофии Дюшенна.

Подбор и синтез РНК-гидов

Подбор РНК-гидов проводили с помощью онлайн-ресурса CHOPCHOP [15]. Для синтеза РНК-гида использовали два частично комплементарных олигонуклеотида — SgR (содержит Т7-промотор) и Sg31 (кодирует сайт g31 в геноме) или SgR и Sg34 (кодирует сайт g34 в геноме). Праймеры были синтезированы компанией «Евроген» (Россия), их последовательности представлены в таблице.

Для получения ДНК-матрицы олигонуклеотиды смешивали в эквимолярном соотношении и амплифицировали в термоциклере Т100 (BioRad, США) по программе: 95 °C — 1 мин; 30 циклов 95 °C — 30 с, 65 °C — 30 с, 72 °C — 30 с; 72 °C — 5 мин, используя набор реагентов GenPack PCR-core kit («Изоген», Россия). Матрицу очищали от продуктов реакции с помощью набора реагентов CleanUp Kit («Евроген», Россия) по протоколу производителя, РНК-гид синтезировали с помощью набора реагентов RiboMax express (Promega, США) и выделяли из реакционной смеси фенол-хлороформной экстракцией с последующим осаждением в изопропаноле [16]. РНК-гид растворяли в воде, свободной от нуклеаз, измеряли концентрацию на приборе NanoDrop 8000 (Thermo Fisher Scientific, США) и хранили при –70 °C.

Для экспериментов по обнаружению вставки в месте разрыва синтезировали матрицу для репарации — одноцепочечный олигонуклеотид длиной 70 нт, состоящий из двух перекрывающихся сайтов рестрикции для ферментов NcoI и BamHI, окруженных плечами гомологии протяженностью 30 нт с каждой стороны. В PAM-сайт были внесены замены, чтобы предотвратить связывание РНК-гида с матрицей для репарации (sg31-HDRt, последовательность представлена в таблице). Синтез был выполнен компанией «Евроген».

Микроинъекции в пронуклеус зиготы и культивирование эмбрионов

У неполовозрелых самок мышей гибридной линии C57BL6 x CBA весом 12–13 г вызывали суперовуляцию введением сначала 5 ед. гонадотропина сыворотки жеребых кобыл (ГСКЖ) и затем через 46–48 ч — 5 ед. хорионического гонадотропина человека (ХГЧ). После инъекции самку сразу подсаживали в клетку к самцу-производителю для спаривания. Овуляция происходила через 11–14 ч после инъекции ХГЧ. Оплодотворенные яйцеклетки вымывали хирургически через 12–13 ч после копуляции (середина темного периода освещения), т. е. через 25–27 ч после инъекции ХГЧ.

Комплекс редактирования генома микроинъецировали преимущественно в мужской пронуклеус зигот мыши на стадии двух пронуклеусов. Зиготы помещали в камеру, состоящую из двух покровных стёкол, закрепленных одно над другим так, что верхний и нижний край капли среды M2 (MTI-GlobalsStem, США) были плоскими и параллельными. Визуализировали пронуклеусы с помощью дифференциального интерференционно-контрастного микроскопа Axiovert 200 (Carl Zeiss, Германия). Иглы для микроинъекции готовили из стеклянных капилляров G100 (Narishige, Япония) на пуллере P97 (Shutter Instruments, США), капилляры-держатели из капилляров GD1 (Narishige) на пуллере PC-10 (Narishige) и микрокузнице MF-900 (Narishige).

Для микроиньекций РНК-гид (50 нг/мкл) смешивали с белком Сas9 (0,1 пМ; NEB, Великобритания) в буфере TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0.1 mM EDTA) и в зависимости от эксперимента — с матрицей для репарации (3 пМ; «Евроген», Россия). Компоненты смешивали непосредственно перед проведением микроинъекций и инкубировали 5 мин при 37 °C для образования комплекса.

После микроинъекции зиготы культивировали в течение 2–3 ч в СО₂-инкубаторе IGO 150 (Thermo Electron Corporation, Франция) при содержании углекислого газа в воздухе 5 % и 100%-й влажности, затем оценивали их визуально и те из них, что находились в удовлетворительном состоянии, оставляли на 3 дня в KSOM-буфере (MTI-GlobalStem, США) для формирования бластоцист. Культивирование проходило в чашках Петри диаметром 35 мм в каплях объемом 50–60 мкл. Сверху капли покрывали легким минеральным маслом категории embryo tested. Все подготовительные процедуры осуществляли в ламинарном боксе.

Подготовка препарата тотальной ДНК бластоцисты и ПЦР-амплификация целевого фрагмента

Под микроскопом каждый эмбрион в объеме 1 мкл последовательно переносили через 3 капли воды для ПЦР («Евроген») с помощью автоматической пипетки и наконечников с фильтрами и помещали в объеме 1 мкл на стенку пробирки объемом 0,2 мл. 1 мкл воды из последней капли использовали в качестве отрицательного контроля для ПЦР. При необходимости на этой стадии образцы замораживали до дальнейшего анализа и хранили при –20 °C. Либо использовали неотмытые бластоцисты, для чего переносили эмбрионы в небольшом объеме среды для инкубации (менее 1 мкл) с помощью стеклянного капилляра на стенку пробирки для анализа.

Для лизиса бластоцист использовали несколько методов: непосредственное добавление бластоцисты в маленьком объеме в реакционную смесь, щелочной лизис (200 mM NaOH, 50 mM DTT) [17]; повторное замораживание и размораживание в воде для ПЦР, лизис с лаурилсаркозилом [18]; обработку протеиназой K с детергентом по методике, описанной Sakurai и соавт. [19]. Последний метод модифицировали, исключив из состава буфера дрожжевую тРНК и увеличив объем буфера на образец до 20 мкл. В пробирки добавляли 20 мкл буфера для лизиса, состоящего из протеиназы К (125 мкг/мл), Tris-HCl (100 мМ, рН 8,3), KCl (100 мМ), желатин 0,02 %, Tween-20 0,45 %. Пробирки инкубировали 10 мин при 56 °C, затем в течение 10 мин при 95 °C для инактивации протеиназы. ПЦР анализ проводили сразу после приготовления образцов или хранили лизат при –20 °C.

Целевой регион вокруг сайта узнавания РНК-гида sg31 амплифицировали c помощью праймеров g31-434F (5’-TCAAACAAAAGGCAGAAGAGTAAG-3’) и g31-434R ( 5 ’ G G T C C A A A G TA G G C C T C G TA - 3 ’ ) , РНК-гида sg34 — с помощью праймеров g34-505F (5’-CAGTGCCCCACACACATACA-3’) и g34-505R (5’-AGCA AAAGTTATTTTAGGGCATACT-3’). В реакцию добавляли от 1 до 10 мкл лизата бластоцист или соответствующего контроля. Для проведения ПЦР использовали набор реагентов GenePack PCR core kit («Изоген», Россия). Программа амплификации: 95 °C — 1 мин; 40 циклов 95 °C — 30 с, 60 °C — 30 с, 72 °C — 30 с; 72 °C — 5 мин. Продукты ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле с интеркалирующим красителем.

Анализ мутаций с помощью эндонуклеазы I фага T7

Короткие делеции и вставки, образующиеся после репарации двуцепочечных разрывов, детектировали с помощью эндонуклеазы I фага T7 (T7EI; NEB, Великобритания). Для этого смешивали ПЦР-продукт с контрольной матрицей, амплифицированной при тех же условиях (по 5 мкл реакционной смеси для каждого фрагмента), и буфером NEB2 (NEB). В конечном объеме 9 мкл проводили отжиг олигонуклеотидов при температуре от 95 до 25 °C со скоростью 0,1 °C/сек. Далее в каждую пробирку добавляли 0,1 ед. активности фермента. Реакцию проводили 1 ч при 37 °C. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле с интеркалирующим красителем. Границы делеций и размеры вставок определяли секвенированием ПЦР-продуктов по Сэнгеру (Центр коллективного пользования «Геном», Россия).

Проверка наличия вставки в геном рестрикцией по сайту BamHI

Одноцепочечный фрагмент ДНК, использованный в качестве матрицы для репарации, кодировал сайты узнавания для двух эндонуклеаз: NcoI и BamHI. ПЦР-продукты, полученные амплификацией участка 8 интрона инъецированных и контрольных эмбрионов, смешивали с буфером FastDigest Green Buffer 10X и добавляли 0,1 ед. активности фермента BamHI (Thermo Fisher Scientific, США). Реакцию проводили 1 ч при 37 °C. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 2 % агарозном геле с интеркалирующим красителем. Наличие вставки подтверждали секвенированием ПЦР-продуктов по Сэнгеру (ЦКП «Геном»).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор методики проведения ПЦР на бластоцистах

В серии экспериментов с использованием различных методов лизиса ПЦР-продукт получили в наибольшем количестве образцов при приготовлении лизата методом, описанным Sakurai и соавт. [19] c модификациями, указанными в методах (результаты не приведены).

Далее было выяснено, что большое значение для воспроизводимости результатов ПЦР имеет подготовка бластоцист к лизису, т. к. компоненты среды могут ингибировать как лизис, так и полимеразу в дальнейшем. В параллельных экспериментах было показано, что при прочих равных условиях перенесение эмбриона в среде для инкубации ухудшает воспроизводимость результатов ПЦР (в среднем 11 успешных реакций на 20 образцов) по сравнению с использованием эмбрионов, отмытых от компонентов среды (20 успешных реакций на 20 образцов). В этом и последующих экспериментах лизис проводили методом Sakurai и соавт. c модификациями.

Чтобы выяснить минимальный объем лизата, который может быть использован в качестве матрицы для амплификации, была проведена соответствующая серия экспериментов. За 40 циклов ПЦР был успешно амплифицирован участок ДНК длиной 434 п. н. с использованием в качестве матрицы от 1 до 10 мкл лизата (рис. 1).

Таким образом, предложенный метод позволяет проанализировать до 20 разных сайтов в геноме мышиного эмбриона на стадии бластоцисты.

Поиск коротких вставок и делеций в сайте g34 гена DMD мышиных эмбрионов после микроинъекций РНК-гида с белком Сas9

В пронуклеус зигот с помощью микроинъекций доставляли РНК-гид sg34 к гену DMD с белком Cas9. 13 эмбрионов на стадии бластоцисты лизировали методом Sakurai и соавт. с модификациями. Фрагмент гена DMD длиной 505 п. н. амплифицировали, используя в качестве матрицы лизаты инъецированных и контрольных эмбрионов. ПЦР-фрагменты были успешно амплифицированы во всех образцах (результаты не приведены).

Далее ПЦР-фрагменты гибридизовали с контрольным образцом и обрабатывали эндонуклеазой I. В 12 из 13 образцах произошло расщепление на 2 фрагмента длиной 300 п. н. и 250 п. н. (рис. 2, А). Четыре ПЦР-фрагмента были выбраны для проверки наличия мутаций в районе связывания РНК-гида секвенированием по Сэнгеру. Результаты представлены на рис. 2, Б. В образце 1 была обнаружена делеция протяженностью 12 нт (с –5 по +7, где за положение +1 был принят нуклеотид N в триплете NGG PAM-сайта). В образцах 2 и 3 размер делеции составил 17 нт (с –11 по +6), а в образце 4 — 38 нт (с –7 по +31).

Обнаружение вставки после гомологичной рекомбинации по месту разрыва

Одноцепочечный олигонуклеотид sg31-HDRt инъецировали вместе с комплексом РНК-гид sg31/белок Cas9 в пронуклеус зигот. 21 эмбрион на стадии бластоцисты использовали для анализа. Участок интрона 8 гена DMD длиной 434 п. н. амплифицировали с инъецированных и контрольных эмбрионов, предварительно лизированных по выбранной методике. ПЦР-продукты обрабатывали рестриктазой BamHI. Результаты представлены на рис. 3. В 11 из 21 обработанных образцов детектировали частичное или полное расщепление на 2 фрагмента. Образец 2 был короче остальных примерно на 50 нуклеотидов, что свидетельствовало о наличии достаточно большой делеции. Образец 5 был потерян в процессе рестриктного анализа (рис. 3, А). Пять образцов (6, 12, 15, 19 и 20) были выбраны для подтверждения наличия вставки в сайте узнавания sg31 секвенированием по Сэнгеру. Вставка была обнаружена во всех последовательностях. В образцах 6, 15 и 19 помимо копии гена со вставкой также была идентифицирована нормальная копия (рис. 3, Б).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Чаще всего для определения успешности проведенных манипуляций при получении генно-модифицированных организмов используют ДНК новорожденных потомков [12]. Однако такой подход требует подсадки оплодотворенных эмбрионов после проведения микроинъекций реципиентам и полного или частичного вынашивания потомства, что отнимает большую часть времени, отведенного на эксперимент. Анализ эмбрионов на стадии бластоцисты, описанный нами, позволяет быстро определить, возможно ли получение генно-модифицированных организмов с использованием подобранного РНК-гида. При этом за счет быстрого получения результатов отпадает необходимость в предварительном тестировании РНК-гидов на культурах клеток, а также возможен статистический анализ. В случаях, когда подсадка оплодотворенных яйцеклеток после проведения микроинъекций не приводит к рождению генно-модифицированных потомков, предложенный метод может помочь определить причины эмбриональной гибели путем анализа неспецифических сайтов связывания РНК-гида или проверить эффективность комплекса РНК-гида с белком Cas9.

Для клональной селекции характерна проблема недостаточного количества ДНК в исходном материале после трансфекции первичных культур клеток, иммортализованных клеточных линий или стволовых клеток плазмидой, кодирующей нуклеазный комплекс. В этом случае выделение геномной ДНК с помощью коммерческих наборов реагентов дорого и низкоэффективно, в то время как предложенный метод получения тотальной ДНК может помочь проанализировать большее количество клонов. Это особенно актуально при проведении вставки в геном с помощью матрицы для гомологичной рекомбинации, т. к. эффективность этого процесса значительно ниже в сравнении с образованием коротких делеций или вставок нуклеотидов.

С применением модифицированного метода получения тотальной ДНК из мышиных эмбрионов отпадает необходимость в полногеномной амплификации, использовании большого количества циклов или проведении нескольких раундов ПЦР. Анализ эмбрионов на стадии бластоцисты не только экономит время и средства исследователя, но также представляется более гуманным в сравнении с постнатальным анализом потомства, поскольку сокращается число животных, вовлекаемых в эксперимент.

Тотальная ДНК, приготовленная предложенным способом из мышиных эмбрионов на стадии бластоцисты, пригодна для анализа коротких делеций или вставок нуклеотидов в сайте разрезания белком Cas9 c помощью эндонуклеазы I из фага Т7 и других аналогичных ферментов, а также специфического гидролиза эндонуклеазами рестрикции при наличии соответствующего сайта. Эндонуклеаза I из фага T7 узнает и расщепляет одноцепочечные участки в составе гетеродуплекса. С ее помощью можно детектировать наличие коротких делеций и вставок по месту двуцепочечного разрыва после гибридизации анализируемого фрагмента с контрольным ампликоном. В некоторых работах ставится под сомнение применимость эндонуклеазы I из фага Т7 для идентификации коротких делеций или вставок нуклеотидов в мышиных эмбрионах [7, 12]. Используя описанный метод подготовки проб, Т7ЕI и секвенирование по Сэнгеру, мы обнаружили высокую эффективность внесения модификаций системой CRISPR/ Cas9 в геном мыши с помощью одного РНК-гида, что согласуется с ранее полученными результатами [1]. Таким образом, было установлено, что амплификация целевого фрагмента с одной бластоцисты с последующей обработкой эндонуклеазой I из фага Т7 — надежный метод обнаружения мутаций после микроинъекций РНК-гида с белком Сas9 в оплодотворенную яйцеклетку. Было показано, что метод подготовки образцов тотальной ДНК из одной бластоцисты пригоден для обнаружения вставок по месту разрыва с помощью рестрикционного анализа. Также мы увидели, что гомологичная рекомбинация по сайту узнавания РНК-гида происходит с меньшей эффективностью, чем негомологичное соединение концов при двуцепочечном разрыве (11/21 против 12/13).

ВЫВОДЫ

В статье описана модификация метода получения тотальной ДНК из мышиных эмбрионов на ранней стадии развития и показано, что большое значение имеет не только правильно подобранная методика лизиса, но и процесс пробоподготовки. Предложенный метод отличается от применяемых в настоящее время простотой и отсутствием необходимости в редких и дорогостоящих реагентах. Используя в качестве матрицы лизат эмбриона на стадии бластоцисты, можно амплифицировать необходимый фрагмент ДНК в один раунд ПЦР, существенно снижая риск искажения результатов и контаминации. При этом компоненты смеси не ингибируют ПЦР и ферментативные реакции, и метод позволяет проанализировать независимо друг от друга до 20 различных фрагментов мышиного генома.

Предложенная модификация метода анализа может быть полезна для амплификации участков ДНК после использования других систем редактирования генома, таких как TAL-эффекторные нуклеазы или нуклеазы по типу цинковых пальцев.