Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — рецессивное, сцепленное с Х-хромосомой наследственное заболевание, которое поражает примерно 1 из 3600 новорожденных-мальчиков и является наиболее распространенным наследственным заболеванием, приводящим к смерти в детском возрасте [1, 2]. При МДД может происходить поражение скелетной, сердечной и гладкомышечной мускулатуры, пищеварительной и выделительной систем, причем скелетная мускулатура поражается в первую очередь. Помимо прогрессирующей мышечной слабости у пациентов наблюдается задержка в развитии, проблемы с дыханием и речью и сердечная недостаточность [3]. При постановке диагноза в среднем в возрасте 5 лет уже к 13 годам более 95 % пациентов оказываются прикованными к инвалидному креслу, а средний возраст, в котором умирает больной, не получавший специального лечения, составляет 19 лет [4].

Так как МДД является Х-сцепленной патологией, ей страдают в большинстве случаев мужчины, которые являются гемизиготами по Х-хромосоме. Болезнь обычно передается сыну от матери-носителя вместе с Х-хромосомой, однако также может возникать de novo в результате мутации в гене дистрофина (DMD) [5]. Ген дистрофина считается самым длинным в геноме человека (2,4 млн пар нуклеотидов [6]) и насчитывает 79 экзонов, а кодируемый им белок содержит около 3700 аминокислотных остатков [7]. Время синтеза мРНК дистрофина составляет около 16 ч [8].

Дистрофин — это структурный белок, который входит в состав костамера, белкового комплекса, отвечающего за соединение актомиозиновых комплексов (саркомеров), плазматической мембраны мышечного волокна (сарколеммы) и белков внеклеточного матрикса [9]. Дистрофин имеет вытянутую форму и одним своим концом крепится к актину, а другим — к мембранному дистрогликановому комплексу, также заякоренному к белку цитоскелета спектрину изнутри и белкам внеклеточного матрикса снаружи клетки.

В отсутствие дистрофина комплексы ассоциированных с ним белков теряют свою стабильность. Известно, что в состав костамеров входят два белковых комплекса: дистрофин-гликопротеиновый и интегрин-винкулин-талиновый, по-видимому, выполняющие сходные функции. Повреждения различных звеньев этой сложной и не до конца изученной системы могут приводить к наследственным миопатиям различных типов [10, 11]. Однако, по-видимому в силу сложного строения системы и дублирования белками костамеров функций друг друга, даже полное отсутствие экспрессии дистрофина, приводящее к МДД, не полностью нарушает связь между акто-миозиновыми комплексами, мембраной и внеклеточным матриксом, а лишь сильно ослабляет ее прочность. Из-за этого хрупкая сарколемма подвергается механическим повреждениям при сокращении. Потеря целостности сарколеммы приводит к некрозу мышечных волокон и воспалению. В первые годы жизни больного его мышечные волокна регенерируют за счет пула миосателлитов — стволовых клеток мышечного дифферона. Однако пул миосателлитов постепенно истощается, что приводит к дегенерации мышц и фиброзу [12].

Дистрофин человека содержит 4 структурных домена: N-концевой актин-связывающий домен; центральный домен, содержащий 24 спектрин-подобных повтора и 4 «шарнирных» участка; цистеин-богатый домен, связывающий β-дистрогликан, и С-концевой домен, связывающий дистробревины и синтрофины. Центральный домен имеет сильно вытянутую форму, и, поскольку каждый спектриподобный повтор состоит из трех α-спиралей, по-видимому, является достаточно гибким и эластичным [12]. По данным анализа известных мутантов, небольшое изменение числа спектриновых повторов, в результате не нарушающих рамку считывания делеций, не сильно сказывается на нормальной работе белка [13].

Обычно к возникновению МДД приводит сдвиг рамки считывания в гене дистрофина, вызывающий преждевременную терминацию трансляции и нонсенс-опосредованный распад мРНК, нонсенс-мутации, а также крупные делеции в участках гена, кодирующие N- и С-концы дистрофина, в результате чего полностью нарушается связывание либо с актином, либо с мембранным комплексом дистрогликанов. Среднего же размера делеции в середине гена, не нарушающие рамки считывания, обычно связаны с другой миопатией: мышечной дистрофией Беккера (МДБ), симптомы которой гораздо менее тяжелые: многие пациенты сохраняют способность к самостоятельному передвижению и в зрелом возрасте [14].

Разрабатывается ряд методов лечения МДД, которые направлены не только на подавление воспаления и фиброза и снижение токсического эффекта избытка кальция в цитоплазме, но и на на восстановление экспрессии дистрофина [15]. Один из наиболее перспективных — пропуск экзонов (exon skipping). Суть метода заключается в том, что с помощью природных олигонуклеотидов или их синтетических аналогов можно исключить некоторые экзоны из зрелой мРНК в ходе сплайсинга за счет стерических помех в работе сплайсеосомы. Таким образом, при наличии сбивающей рамку считывания делеции или нонсенс-мутации с помощью исключения одного или нескольких экзонов можно добиться того, чтобы вся последующая часть гена транслировалась в правильной рамке [16]. Трансляция неполного, но сохраняющего хотя бы частичную функциональность белка, может значительно улучшить состояние пациентов с МДД, особенно если лечение было начато в раннем возрасте [1].

Одно из первых исследований по коррекции МДД методом пропуска экзонов провели с участием четырех пациентов, носителей гена дистрофина с нарушающей рамку считывания делецией одного или нескольких экзонов: 50, 52, 49–50 и 48–50. Во всех четырех случаях индукция пропуска 51-го экзона теоретически восстанавливала рамку считывания гена. Лечение проводили путем внутримышечных инъекций антисенс-олигонуклеотидов, и хотя эффективность пропуска экзонов составила 46–90 %, показатели стандартных физиологических тестов не улучшились [17].

Тем не менее, по оценке Aartsma-Rus и van Ommen [18], пропуск экзонов может помочь большинству пациентов с МДД. Исключения будут составлять мутации, расположенные между экзонами 64 и 70, которые, по-видимому, являются необходимыми для функционирования дистрофина, а также делеции, разрушающие актин-связывающие домены в N-концевой области или затрагивающие первый или последний экзон, и крупные хромосомные перестройки вроде транслокаций. Однако вышеперечисленные мутации достаточно редки и вместе составляют менее 10 % от всех описанных мутаций в гене дистрофина. Таким образом, теоретически примерно у 90 % пациентов с МДД экспрессию функционального или частично функционального белка можно восстановить при помощи пропуска экзонов.

Предсказание и анализ эффективности терапии методом пропуска экзонов является важной прикладной задачей, т. к. из-за большого размера гена частота мутаций в нем весьма велика и примерно каждый третий пациент обладает de novo мутацией [13]. Важным теоретическим аспектом применимости метода является оценка функциональности форм дистрофина, укороченного в результате пропуска экзонов. Именно такая оценка являлась целью данной работы. Для ее проведения следовало определиться с тем, какие мутации можно проанализировать, как их можно корректировать (т. е. пропуск каких экзонов приведет к восстановлению экспрессии дистрофина) и какие методы анализа фенотипического проявления мутаций можно использовать. Мы изучили и обобщили литературные данные по этим аспектам исследования.

Самый простой случай для коррекции гена DMD — это наличие нонсенс-мутаций или приводящих к сдвигу рамки считывания вставок и делеций (инделов) в пределах одного экзона. Теоретически такие мутации можно корректировать путем пропуска одного или группы соседних экзонов, удаление которых из зрелой мРНК не приведет к сдвигу рамки считывания. При этом могут быть пропущены не более 7 экзонов — именно столько метод позволяет не включать в зрелую мРНК без потери эффективности [18].

Из 79 экзонов гена дистрофина 34 можно удалить без нарушения рамки считывания, а мутации еще в 29 корректируют удалением самого экзона вместе с одним из соседних. Причем для восьми экзонов из этих 29 совместно удаляемым может быть как предшествующий, так и следующий экзон (рис. 1). Ошибки в оставшихся четырнадцати экзонах корректируют удалением большего числа эк- зонов: экзоны 6–8 без сдвига рамки считывания удаляют только вместе, также как и экзоны 76–78; экзоны 61 и 71 удаляют только с двумя предшествующими, а экзон 67 — с двумя соседними; экзоны 72 и 73 — только вместе со всеми предшествующими вплоть до 69-го (четыре и пять экзонов соответственно); экзон 74 можно удалить по тому же принципу или же в составе блока экзонов 70–75 (шесть экзонов в обоих вариантах), а экзон 75 — только с пятью предыдущими. Для коррекции экзона 2 требуется удаление шести экзонов, однако, по данным Wein и соавт. [19], делеция экзона 2 приводит к бессимптомному или очень слабому течению заболевания, т. к. трансляция начинается с внутреннего сайта посадки рибосомы в экзоне 5, и в этом случае укороченный дистрофин сохраняет функциональность. Коррекция же мутаций в первом и последнем экзонах считается невозможной (хотя в свете наличия внутреннего сайта посадки рибосомы в экзоне 5 это может оказаться неверно). Таким образом, теоретически мутации в 75 экзонах можно скорректировать пропуском не более шести экзонов, что соответствует оговоренному ограничению метода пропуска экзонов.

Число возможных коррекций простых одиночных замен, вставок или делеций в гене дистрофина чрезвычайно велико, и экспериментальная проверка всех комбинаций на животных моделях вряд ли представляется возможной. Кроме того, даже на мышах не удается хорошо воспроизвести человеческий фенотип МДД [20]. Более реальным подходом к решению поставленной задачи является анализ большого массива клинических данных пациентов с мутациями в гене дистрофина, приводящими к МДД или МДБ. Получение достаточной выборки по литературным источникам — это трудоемкий процесс, осложняемый тем, что не для всех мутаций есть опубликованные данные. К счастью, существуют базы данных генетических вариаций. Одна из них, LOVD (Leiden Open Variation Database — Лейденская открытая база генетических вариаций) [21], содержит записи о различных мутациях в гене дистрофина, информацию о половой и популяционной принадлежности их носителей, методе, которым был выполнен анализ и, что наиболее ценно, данные о фенотипе, к которому приводит та или иная мутация у конкретного пациента: МДД, МДБ или бессимптомное течение. Пользователи со всего мира могут самостоятельно пополнять LOVD, что является как достоинством (обширность данных), так и недостатком (потенциально большое количество ошибок) базы. По состоянию на июнь 2016 г. LOVD содержит более 16 000 неуникальных записей о мутациях в гене дистрофина, затрагивающих целиком один или несколько экзонов. Среди них 83 % составляют делеции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Данные о мутациях находили при помощи встроенного текстового поиска LOVD [22]. Поисковый запрос вводили в поле Exon. Его составляли в соответствии с номенклатурой базы данных: для экзона N — N-1i_Ni, что означает, что мутация должна затрагивать соседние с экзоном интроны. Например, для поиска делеции экзона 3 составляли запрос 2i_3i. Для делеции группы экзонов запрос осуществляли аналогично. Для анализа брали только записи, содержащие информацию о полных делециях целевых экзонов (экзонов, с помощью которых можно корректировать нонсенс-мутации или внутриэкзонные инделы). Из полученного списка исключали дупликации, а также мутации, носителями которых являлись женщины.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Соотношение фенотипов, соответствующих выбранным для коррекции рамки считывания комбинациям экзонов, представлено на рис. 2. Для 25 делеций в LOVD не нашлось ни одной записи, причем большая часть таких делеций находится в области центрального домена, а также в районе экзонов 65–78. Лишь у 11 комбинаций количество найденных в базе данных случаев превышало 5. Распределение этих 11 комбинаций по доменам дистрофина крайне неравномерно: 7 из них относятся к комбинациям, корректирующим экзоны 45–55 (С-концевая часть центрального домена), еще одна — делеция экзона 13 — затрагивает N-концевую часть центрального домена, а 3 перекрывают N-концевой актин-связывающий домен.

Среди всех представленных в базе данных случаев, соответствующих выбранным делециям, в 45 % регистрируют МДБ или отсутствие симптомов заболевания, тогда как крупные делеции экзонов, приводящие к сдвигу рамки считывания, реализуются как МДБ менее чем в 4 % случаев, что говорит о более мягком течении мышечной дистрофии у пациентов с не нарушающими рамку считывания делециями.

Было также обнаружено, что одни и те же мутации способны проявляться как различные фенотипы. Так, делеция экзона 48, которая встречается в базе данных 97 раз, может протекать бессимптомно (2 % случаев) или приводить к МДБ (60 % случаев), МДД (12 % случаев) или промежуточному фенотипу (26 % случаев). Еще любопытнее делеции экзонов 50–51 и 51–52, для которых описаны 14 и 11 случаев соответственно: если для первой количество случаев бессимптомного течения заболевания или МДБ составляет 6 (43 %), то для второй — ни одного, хотя обе делеции не затрагивают ничего, кроме «шарнирного» участка и одного из спектриновых повторов центрального домена, и, казалось бы, не должны оказывать значимого влияния на структуру белка. Другой часто встречающейся делецией (13 случаев), не нарушающей рамку считывания и не затрагивающей ничего, кроме спектринового повтора, но при этом в 100 % случаев проявляющейся как МДД или смешанный фенотип, является делеция экзона 47.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Количество записей о пациентах-носителях различных делеций в базе данных достаточно сильно варьирует. Причинами этого могут быть как неодинаковая частота мутаций в разных участках гена, так и недопредставленность какой-либо группы мутаций в базе данных. Действительно, такое распределение вполне можно объяснить наличием описанных в литературе «горячих точек» мейотической рекомбинации в районе экзонов 7 и 44 [23]. Отсутствие же информации о делециях в области центрального домена можно объяснить в основном бессимптомным течением заболевания при таких делециях, что, скорее всего, сильно снижает вероятность обнаружения таких мутаций. Однако необычным является тот факт, что в базе данных не представлена ни одна из комбинаций для коррекции мутаций в экзонах 65–78. Одним из объяснений может служить больший размер перекрывающих С-конец комбинаций по сравнению с остальными.

По данным Aartsma-Rus и соавт. [24], 91 % мутаций в базе данных LOVD подчиняются следующему правилу: мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания и трансляции укороченного нефункционального дистрофина, являются причиной МДД, а мутации, не приводящие к сдвигу рамки считывания, обычно почти не отражаются на функциональности дистрофина и вызывают МДБ, если не затрагивают ключевых для работы белка доменов, расположенных на его N- и C-концах.

Подтверждением этого правила, по-видимому, является случай, описанный в статье Passos-Bueno и соавт. [25]. В работе речь идет о пациенте с МДБ, которую вызывает крупная не нарушающая рамку считывания делеция (с 13-го по 48-й экзоны). Эта делеция захватывает 18 из 24 спектриновых повторов центрального домена, но не трогает N- и С-концы. От всей аминокислотной последовательности белка остается примерно половина, чего, по мнению авторов работы, достаточно для частичного выполнения дистрофином своей функции. Однако из этого правила есть интересные исключения. Например, в работе Takeshima и соавт. [26] описывается случай крупной N-концевой делеции (с 3-го по 41-й экзоны), не нарушающей рамку считывания, которая проявляется в форме промежуточного фенотипа между МДД и МДБ. Отсутствие N-концевого домена делает дистрофин нефункциональным, тем не менее, фенотип пациента не соответствует классической картине течения МДД.

Другим исключением является описываемая в работе Suminaga и соавт. [27] нонсенс-мутация в экзоне 76, которая приводит к синтезу укороченной формы дистрофина, обнаруживаемой иммуногистохимически на препаратах из биоптата мышц. При этом за исключением повышенного уровня креатинфосфаткиназы в крови (что является одним из основных маркеров МДД и МДБ) других симптомов мышечной дистрофии у пациента не выявлено. Авторы работы пишут, что не могут как-либо объяснить полученную картину: другая описанная в литературе нонсенс-мутация, которая обрезает белок лишь на 10 аминокислот ближе к началу, чем найденная в работе, приводит к типичной картине течения МДД [28]. В работе были проверены разные предположения о возможных причинах такого фенотипа: соматический мозаицизм, восстановление рамки считывания из-за альтернативного сплайсинга, компенсаторный высокий уровень экспрессии утропина, белка-гомолога дистрофина, однако все они были отвергнуты.

Как видно из анализа базы данных и перечисленных выше случаев, одни и те же мутации в гене дистрофина могут приводить к различным фенотипам. Причины этого явления до конца не ясны, но, вероятно, его можно объяснить разным генетическим фоном пациентов. Это проблема, т. к. даже если у пациента удастся вызвать эффективный пропуск экзона или экзонов, приводящий к восстановлению рамки считывания, и будет наблюдаться синтез укороченного дистрофина, нет гарантий, что его состояние улучшится. Кроме того, из-за недостаточной изученности проблемы не существует достоверной методики предсказания того, поможет ли восстановление рамки считывания конкретному пациенту. Статистический анализ в данном случае также затруднен, поскольку лишь для небольшого числа делеций достаточно фенотипических данных.

В нашей работе не были рассмотрены некоторые варианты укороченных дистрофинов, получаемых при коррекции методом пропуска экзонов более сложных для анализа мутаций: крупных делеций, затрагивающих минимум один экзон целиком и вызывающих сдвиг рамки считывания, и дупликаций одного или нескольких экзонов. Часть из них может быть скорректирована пропуском тех же экзонов, что и в случае с внутриэкзонными мутациями, например дупликации экзонов, делеция которых не вызывает сдвиг рамки считывания, или делеции одного экзона, которые могут быть скорректированы пропуском соседнего. Так, дупликация экзона 13 при пропуске обеих копий экзона сведется к делеции экзона 13, а делеция экзона 51 может быть скорректирована пропуском экзона 50 или экзона 52. Коррекция некоторых дупликаций двух и более экзонов и крупных, приводящих к сдвигу рамки считывания и затрагивающих два и более экзонов делеций также осуществима. Так, делеция c 7-го по 34-й экзон может быть скорректирована пропуском 6-го. Полученная делеция не будет нарушать рамку считывания, однако неизвестно, будет ли такая форма дистрофина функциональной, а данные в LOVD о подобной мутации отсутствуют. В итоге решено было не проводить детальный анализ таких мутаций из-за большого количества комбинаций и недостатка данных о функциональности получающихся в результате их коррекции форм дистрофина.

ВЫВОДЫ

Проведенный в работе анализ данных о фенотипичесих проявлениях мутаций в гене дистрофина показал, что одни и те же мутации могут реализовываться различными фенотипами. Это указывает на то, что успех применения метода пропуска экзонов для лечения мышечной дистрофии Дюшенна имеет вероятностный характер даже в случае высокой эффективности индукции альтернативного сплайсинга и точная оценка вероятности успеха для конкретного варианта терапии затруднена из-за недостатка данных. Можно, однако, надеяться, что с развитием методов высокопроизводительного секвенирования ДНК и их удешевлением ситуация изменится.