Бронхиальная астма (БА) — это хроническое воспалительное заболевание верхних дыхательных путей, которое сопровождается обструкцией бронхов и их гиперреактивностью и проявляется эпизодами затруднения дыхания, хрипов, кашля, приступами удушья. Относится к числу патологий с высоким темпом роста заболеваемости, особенно в экономически развитых странах. По данным Российского респираторного общества, на сегодняшний день количество больных БА в России приближается к 10 млн человек, при этом доля детей среди них составляет более 20 % [1].

Замечено, что больные БА тяжелее переносят заболевания, вызванные респираторными инфекциями, нежели здоровые люди [2, 3]. С острыми респираторными инфекциями верхних дыхательных путей связана высокая частота обострений БА: около 85 % обострений у детей и 50 % — у взрослых вызываются именно респираторными вирусами [2]. Возбудители повреждают мерцательный эпителий слизистой оболочки дыхательного тракта, тем самым увеличивая ее проницаемость для аллергенов и токсических веществ и усиливая бронхиальную гиперреактивность. Тяжелое обострение может угрожать жизни больного, причем оно может развиться при БА любой степени [3].

Многие современные исследования посвящены углубленному изучению патогенеза БА, в частности, роли элементов врожденного иммунитета. Активно изучают новый класс эффекторных молекул — противомикробные пептиды, к которым относятся β-дефенсины. Противомикробные свойства последних обусловлены электростатическим взаимодействием между отрицательно заряженными поверхностными компонентами бактериальной мембраны, такими как липополисахариды грамотрицательных бактерий и тейхоевые и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, и положительно заряженной молекулой β-дефенсина. При критической концентрации β-дефенсинов на поверхности клетки-мишени в ее мембране образуются поры и происходит лизис клетки. Кроме того, β-дефенсины обладают иммунорегуляторной активностью: участвуют в хемотаксисе, индукции адаптивного иммунитета, созревании дендритных клеток и пр. [4].

Наиболее важную роль в защите слизистых оболочек респираторного тракта играет β-дефенсин-1 (human beta defensin-1, HBD-1), конститутивно синтезируемый эпителиальными клетками [5]. β-дефенсин-1 кодируется геном DEFB1, который расположен на коротком плече хромосомы 8 (8p23.1) в высокополиморфном кластере. Мутации в гене могут снижать его экспрессию, а недостаточная секреция β-дефенсинов вызывает ассоциированное прилипание и инвазию бактерий в слизистую и начало воспаления [6, 7].

Другой важный элемент врожденного иммунитета — toll-подобные рецепторы (toll-like receptors, TLRs) эпителиальных клеток слизистой оболочки дыхательных путей, которые распознают патоген-ассоциированные молекулярные структуры (pathogen-associated molecular patterns, РАМРs) микроорганизмов и продуктов их жизнедеятельности, передают сигнал внутрь клетки и вызывают повышение функциональной активности лейкоцитов, а также экспрессию генов провоспалительных цитокинов и интерферонов. Наиболее широкий спектр бактериальных и вирусных патогенов распознается TLR2, TLR4, TLR9, которые могут активировать врожденный иммунитет локально, на уровне слизистых оболочек дыхательных путей.

Целью работы являлась комплексная оценка показателей врожденного иммунитета — уровней экспрессии генов TLR2, TLR4, TLR9 и DEFB1, а также изучение ассоциации некоторых однонуклеотидных полиморфизмов (single nucleotide polymorphism, SNP), локализованных в 5’-нетранслируемой области гена DEFB1, с бронхиальной астмой у детей. В качестве маркеров интереса выбрали три SNP: rs1799946, rs1800972 и rs11362. Установлено, что они ассоциированы с ВИЧ-инфекцией, инфекциями, вызываемыми Candida albicans, Pseudomonas aeruginosa и другими микроорганизмами, развитием сепсиса [8, 9], однако данные об их ассоциации с аллергическими заболеваниями отсутствуют.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании приняли участие пациенты отделения восстановительного лечения детей с аллергическими болезнями и заболеваниями органов дыхания Научного центра здоровья детей (г. Москва): 48 детей в возрасте 3–7 лет с бронхиальной астмой. В контрольную группу включили 70 детей без заболеваний органов дыхания, инфекционно-воспалительных и аллергических заболеваний. В качестве клинического материала использовали соcкобы со слизистой оболочки полости носа, взятые в период обострения БА на фоне острого респираторного заболевания.

Для исследования полиморфизмов гена DEFB1 ДНК из клинического материала выделяли с использованием набора «АмплиПРАЙМ Рибо-сорб» («ИнтерЛабСервис», Россия) и ставили полимеразную цепную реакцию «в реальномвремени» (ПЦР-РВ) с использованиемнабора «ПЦР-комплект» (в присутствии красителя SYBR Green I) («Синтол», Россия). Статистическую обработку данных проводили в MO Excel 2007 со статистическим пакетом Statistica 10.0 (StatSoft, США). Рассчитывали критерий согласия Пирсона и Odd Ratio (OR >1 — ассоциация генотипа с БА, OR <1 — протективный в отношении БА генотип) [10].

Уровень экспрессии генов DEFB1, TLR2, TLR4 и TLR9 исследовали относительно уровня экспрессии гена β-актина. РНК выделяли из клинического материала с использованием набора «АмплиПРАЙМ Рибосорб», проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора «ОТ-1» («Синтол») и ставили ПЦР-РВ с использованием набора «ПЦР-комплект» (в присутствии красителя SYBR Green I). При статистической обработке данных использовали критерий Манна–Уитни (р <0,05).

Исследование было одобрено этическим комитетом Российского национального исследовательского медицинского университета имени Н. И. Пирогова. Родители подписали информированное согласие на участие детей в исследовании.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров rs1799946, rs1800972 и rs11362 гена DEFB1 показало, что с риском развития бронхиальной астмы у детей ассоциированы генотипы AA маркера rs11362 и СС маркера rs1799946, а генотипы GG и AA маркеров rs1799946 и rs1200972 соответственно являются протективными (рис. 1). Характер распределения частот аллелей гена DEFB1 в обеих группах был сходным.

Уровень экспрессии гена DEFB1 у больных детей был в 3,5 раза ниже, чем у здоровых (рис. 2). Однонуклеотидная замена в промоторной области гена может повлиять на эффективность его транскрипции гена и количество синтезируемого белка. Мы разделили пациентов опытной группы на три подгруппы в соответствии с уровнями экспрессии гена β-дефенсина-1: с низкими (выше уровня экспрессии гена β-актина менее чем в 10 тыс. раз), средними (выше уровня экспрессии гена β-актина в 10–30 тыс. раз) и высокими (выше уровня экспрессии гена β-актина более чем в 30 тыс. раз). Было установлено, что генотип АG маркера rs11362 ассоциирован с увеличением уровня экспрессии β-дефенсина-1 в эпителиальных клетках. Так, частота генотипа АG в группах пациентов с высоким и низким уровнями экспрессии гена DEFB1 составила 0,67 и 0,30 соответственно. Генотип АА ассоциирован с пониженной экспрессией гена дефенсина. Другие генотипы выбранных маркеров не ассоциированы с изменением уровня экспрессии гена дефенсина в исследованной нами группе.

У больных бронхиальной астмой выявили повышение уровня экспрессии гена TLR2 в сравнении с контрольной группой в 19,5 раз, TLR9 — в 9,5 раз, TLR4 — в 8,3 раза. Результаты представлены в таблице.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные результаты могут указывать на то, что развитие хронического воспаления слизистой бронхов у детей с бронхиальной астмой отчасти обуславливается мутациями в 5’-нетранслируемой области гена DEFB1. На основании полученных данных об уровнях экспрессии генов DEFB1 и TLR2, TLR4, TLR9 была выдвинута гипотеза о роли β-дефенсина-1 в патогенезе БА. Противомикробные пептиды, продуцируемые эпителием слизистой оболочки респираторного тракта, предотвращают вторжение патогенов в слизистую. Однако если продукция противомикробных пептидов снижена, а бактериальная нагрузка увеличена, то патогены распознаются TLRs эпителиальных клеток и запускается каскад провоспалительных реакций, в том числе индукция синтеза интерлейкинов (IL-1β, IL-6, IL-12), интерферона α, интерферона β и хемокинов. Кроме того, через активацию эпителиальных TLRs индуцируется выработка тимусного стромального лимфопоэтина (thymic stromal lymphopoietin, TSLP) и интерлейкина IL-33, которые взаимодействуют с дендритными клетками, увеличивают активность костимулирующих молекул CD40, CD80 и направляют дифференцировку клеток Th0 в Th2, а также напрямую взаимодействуют с тучными клетками, вызывая их дегрануляцию [11, 12]. Это приводит к развитию хронической воспалительной реакции (рис. 3).

ВЫВОДЫ

Генотип АА полиморфизма rs11362 и генотип СС полиморфизма rs1799946, расположенных в 5’-нетранслируемой области гена DEFB1, достоверно ассоциированы с бронхиальной астмой у детей. Генотип GG полиморфизма rs1799946 и генотип АА полиморфизма rs120097) являются протективными. Генотип АА полиморфизма rs11362 также ассоциирован с пониженной экспрессией, а генотип AG — с повышенной экспрессией гена β-дефенсина-1 DEFB1. Таким образом, некоторые мутации в гене DEFB1 приводят к возникновению дисбаланса в системе врожденного иммунитета на уровне слизистой оболочки полости носа, который становится причиной частых обострений БА на фоне респираторных инфекций.