ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Динамика функциональной активности тиреоцитов при изменении морфофункционального состояния тучных клеток щитовидной железы под воздействием инфракрасного лазерного излучения
Информация об авторах
1 Многопрофильный центр лазерной медицины, Челябинск
2 Южно-Уральский государственный медицинский университет, Челябинск
Для корреспонденции: Ирина Викторовна Смелова
ул. Потемкина, д. 14, кв. 65, г. Челябинск, 454081; ur.liam@vis.larips
Статья получена: 28.11.2016
Статья принята к печати: 12.12.2016
Опубликовано online: 19.01.2017
|
В последнее десятилетие в клинической практике все большее распространение получают новые методы терапии с применением лазерных технологий. Наряду с активным использованием низкоинтенсивных режимов лазеров [1], разрабатываются методики на основе лазерного воздействия повышенной мощности, позволяющего достигать терапевтических доз в глубине ткани [2, 3].
Щитовидная железа доступна для прямого лазерного воздействия с поверхности тела. Лазерное облучение щитовидной железы может изменять ее функцию, способствовать повышению уровня секреции гормонов, улучшать микроциркуляцию и влиять на репарацию тканей органа, поэтому применяется при лечении гипотиреоза и аутоиммунных тиреоидитов [4, 5, 6, 7]. Существует точка зрения, что триггером структурных изменений тиреоидного эпителия является воздействие фотонов света на строму железы, в том числе на содержащиеся в ней иммунные клетки. Известно, что при низкоинтенсивном лазерном воздействии на щитовидную железу возрастает секреция тиреоидных гормонов [8].
Гормоны щитовидной железы, точкой приложения которых является ядерный аппарат клетки, участвуют в обменных процессах всех видов, влияют на активность ферментных систем, способствуют росту, развитию и дифференцировке всех тканей организма. Неоспоримо влияние тиреоидных гормонов на центральную и периферическую нервную систему и высшую нервную деятельность и другие железы внутренней секреции.
Основная функция тиреотропного гормона (ТТГ), продуцируемого клетками передней доли гипофиза, — регуляция синтеза и секреции гормонов щитовидной железы по принципу обратной связи. Функциональное состояние щитовидной железы оценивается по содержанию гормонов тироксина (Т4) и трийодтиронина (Т3) в сыворотке крови, причем концентрация их свободных фракций является более надежным параметром.
Стромальные тучные клетки щитовидной железы (мастоциты) обладают высокой функциональной активностью за счет продукции большого числа медиаторов, цитокинов и ферментов. Показано их участие в регуляции микроциркуляции и ангиогенеза, ответе тканей на повреждающие экстремальные воздействия, воспалительных и аллергических реакциях [9]. Биологически активные вещества дегранулированных тучных клеток влияют на состояние микроциркуляторного русла и эпителия фолликулов, а также играют важную роль в репаративной регенерации железы и могут изменять ее функциональную активность [10]. Лазерное воздействие на ткани вызывает дегрануляцию мастоцитов [11, 12].
Остаются неизученными эффекты среднеинтенсивного лазерного воздействия на функциональную активность тучных клеток щитовидной железы в зависимости от дозы излучения. Целью работы являлось изучение влияния различных доз среднеинтенсивного инфракрасного лазерного облучения на функциональное состояние стромальных тучных клеток с оценкой по степени их дегрануляции и функциональное состояние тиреоцитов с оценкой по содержанию тиреоидных гормонов в сыворотке крови в норме и при экспериментальном гипотиреозе.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент провели на 78 беспородных половозрелых самцах лабораторной крысы весом 200–220 г, содержавшихся в условиях вивария в клетках по 2–3 особи ad libitum, на сбалансированном рационе и при обычном световом режиме (день–ночь). Опыт проведен с соблюдением норм и правил гуманного обращения с животными, в том числе в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к Приказу МЗ СССР No 755 от 12.09.77) и Хельсинкской декларацией 1964 г. с изменениями от 1975, 1983 и 1989 гг.
Животных разделили на 6 групп: 1) интактные животные; 2) животные с экспериментальным гипотиреозом; 3) интактные животные, для которых суммарная плотность дозы составила 112 Дж/см2 (экспозиция — 45 с); 4) интактные животные, для которых суммарная плотность дозы составила 450 Дж/см2 (экспозиция — 60 с) 5) животные с экспериментальным гипотиреозом, для которых суммарная плотность дозы составила 112 Дж/см2 (экспозиция — 45 с); 6) животные с экспериментальным гипотиреозом, для которых суммарная плотность дозы составила 450 Дж/см2 (экспозиция — 60 с). Лазером воздействовали в непрерывном режиме ежедневно в течение 5 дней, начиная со следующего дня после окончания моделирования гипотиреоза. Работали на аппарате «ИРЭ-Полюс» с длиной волны 970 нм (НТО «ИРЭ-Полюс», Россия). Режим лазерного воздействия с суммарной плотностью дозы 450 Дж/см2 не вызывал термических повреждений тканей щитовидной железы.
Гипотиреоз моделировали ежедневным пероральным введением в течение 21 суток «Мерказолила» (действующее вещество — тиамазол; производство: «Акрихин», Россия) в дозе 25 мг/кг с помощью специального зонда [13]. Интактным животным по той же схеме перорально вводили 0,9 % физиологический раствор. Оценку гипотиреоза проводили по клиническим признакам: изменению массы тела, аппетита, состояния шерсти, температуры, — а также по морфологическому состоянию щитовидной железы и содержанию тиреоидных гормонов в сыворотке крови.
Выведение животных из эксперимента осуществляли под эфирным наркозом путем цервикальной дислокации через 1, 7 и 30 суток после окончания облучения.
Материал для морфологического исследования забирали в 10 % раствор нейтрального формалина, затем готовили стандартные гистологические парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилином–эозином и толуидиновым синим (рН = 2,0). Микроскопические исследования проводили на микроскопе DMRXA (Leica, Германия). Результаты фиксировали с помощью программы анализа изображений «ДиаМорф Cito-W» (Россия), совмещенной с микроскопом. Морфометрический анализ гистологических срезов включал подсчет общего количества тучных клеток и тучных клеток в разной степени дегрануляции и расчет коэффициента дегрануляции. Подсчет тучных клеток производили по 10 полям зрения в каждом препарате с последующим пересчетом на 1 мм2. По степени дегрануляции мастоциты разделили на 3 группы: 1) I ст. — 1–2 гранулы за пределами цитоплазмы; 2) II ст. — 3–10 гранул за пределами цитоплазмы; 3) III ст. — более 10 гранул за пределами цитоплазмы. Коэффициент дегрануляции рассчитывали как отношение количества дегранулированных клеток к общему количеству тучных клеток.
Содержание гормонов в сыворотке крови крыс определяли методом иммуноферментного анализа на автоматическом иммуноферментном анализаторе Personal LAB (Adaltis, Италия) с использованием набора реагентов компании Cusabio Biotech (Китай) — для определения содержания ТТГ и набора реагентов компании «Вектор-Бест» (Россия) — для определения содержания тироксина и трийодтиронина в свободной и связанной фракциях.
Статистическую обработку результатов провели при помощи программного обеспечения Microsoft Excel, SPSS Statistics 20 (IBM, США), используя непараметрические методы: вычисление медианы, верхнего и нижнего квартилей. Для оценки значимости различий при межгрупповом сравнении использовали критерий Манна–Уитни. Различия считали значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
У животных с экспериментальным гипотиреозом, не проходивших облучение, общее количество тучных клеток щитовидной железы достоверно не отличалось от значения этого показателя у интактных животных (табл. 1). У животных, выведенных из эксперимента через 1 сутки после моделирования гипотиреоза, было отмечено снижение количества тучных клеток I степени дегрануляции в сравнении с интактными крысами (табл. 2). Сравнение этих же групп при выведении животных из эксперимента через месяц показало достоверное повышение количества мастоцитов II и III степени дегрануляции и увеличение значения коэффициента дегрануляции.
При сопоставлении значений содержания гормонов Т4 и Т3 в сыворотке крови интактных животных и животных с экспериментальным гипотиреозом у последних наблюдали статистически значимое снижение содержания свободной фракции Т4 и повышение содержания ТТГ во все сроки выведения из эксперимента (табл. 3).
После лазерного облучения щитовидной железы интактных животных на ранних сроках (сутки и неделя) выведения из эксперимента изменения количества и активности мастоцитов не происходило независимо от суммарной плотности дозы, кроме снижения числа тучных клеток I степени дегрануляции через сутки выведения из эксперимента при дозе 112 Дж/см2 (табл. 2). На 30-е сутки после облучения дозой 112 Дж/см2 наблюдали увеличение общего количества дегранулированных мастоцитов, мастоцитов I и II степени дегрануляции, значения коэффициента дегрануляции и — снижение количества мастоцитов I степени дегрануляции. В этот же срок общее количество тучных клеток в щитовидной железе интактных животных после облучения достоверно не изменялось.
Лазерное облучение щитовидной железы интактных крыс при суммарной плотности дозы 112 Дж/см2 способствовало понижению сывороточной концентрации ТТГ и повышению содержания свободного Т4, свободного и общего Т3 при заборе крови через сутки после выведения животных из эксперимента (табл. 3).
В подгруппе животных с экспериментальный гипотиреозом, получивших облучение в дозе 112 Дж/см2 и выведенных из эксперимента через сутки, наблюдали статистически значимое увеличение общего количества тучных клеток, общего количества дегранулированных мастоцитов, в том числе всех степеней дегрануляции, и значения коэффициента дегрануляции (при сравнении с крысами с гипотиреозом, не получивших облучения) (табл. 1, табл. 2). Через месяц достоверно уменьшалось общее количество мастоцитов, общее количество дегранулированных тучных клеток и мастоцитов III степени дегрануляции. Также наблюдали статистически значимое изменение уровня гормональной секреции: уменьшение содержания ТТГ, увеличение содержания свободной и связанной фракций Т4 и Т3 через неделю и месяц после выведения животных из эксперимента.
При воздействии на щитовидную железу животных с экспериментальным гипотиреозом лазером в дозе 450 Дж/см2 через неделю наблюдали снижение содержания тучных клеток II степени дегрануляции, а через месяц — снижение общего количества дегранулированных мастоцитов, тучных клеток II и III степени дегрануляции, значения коэффициента дегрануляции и содержания гормонов (при сравнении с крысами с гипотиреозом, не получивших облучения) (табл. 1, табл. 2).
При сравнении между собой групп животных с экспериментальным гипотиреозом, получивших облучение в разных дозах, обнаружили, что лазерное воздействие с суммарность плотностью дозы 450 Дж/см2 приводило к уменьшению количества дегранулированных тучных клеток, значения коэффициента дегрануляции и снижению содержания гормонов во все сроки выведения животных из эксперимента.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Механизм действия тиамазола заключается в нарушении синтеза гормонов тиреоцитами щитовидной железы вследствие блокирования фермента пероксидазы, участвующей в йодировании тиронина с образованием Т3 и Т4, что способствует развитию гипотиреоза. Тучные клетки принимают участие в паракринной регуляции в норме и при патологии за счет содержания большого количества биологически активных веществ в их гранулах. Дегрануляция мастоцитов может регулироваться цитокинами, гормонами, нейропептидами. Это позволяет предположить наличие взаимосвязи между функциональным состоянием стромальных тучных клеток и функциональным состоянием тиреоцитов. Гипотеза требует проверки.
Анализируя полученные данные, можем предположить, что отсутствие существенных изменений уровня дегрануляции тучных клеток через 1 сутки после выведения животных с гипотиреозом из эксперимента (в сравнении с интактными животными, не получивших облучение) является косвенным свидетельством тормозящего эффекта тиамазола в отношении функциональной активности не только тиреоцитов, но и мастоцитов. Повышение количества мастоцитов II и III степени дегрануляции и увеличение значения коэффициента дегрануляции через месяц после выведения животных из эксперимента (при сравнении этих же групп), вероятно, отражает регенеративные процессы в ответ на повреждающее воздействия тиреостатика и является одним из показателей усиления функциональной активности щитовидной железы [10].
Снижение содержания свободной фракции Т4 и повышение содержания ТТГ во все сроки выведения из эксперимента у животных с экспериментальным гипотиреозом в сравнении с интактными крысами, отмеченные в нашем исследовании, подтверждают развитие гипотиреоза и угнетение компенсаторных механизмов организма. Увеличение содержания свободной фракции Т3 в эти сроки, вероятно, свидетельствует о повышенном дейодировании Т4 в периферических тканях для восстановления регуляторных функций.
Активация тучных клеток в щитовидной железе животных с гипотиреозом, получивших облучение в дозе 112 Дж/см2 и выведенных из эксперимента через сутки, и уменьшение их активности через месяц, а также снижение содержания ТТГ и увеличение содержания свободной и связанной фракций Т4 и Т3 через неделю и через месяц после лазерного воздействия позволяют говорить о стимулирующем эффекте этой дозы в отношении мастоцитов и ее положительном влиянии на функциональную активность тиреоцитов при гипотиреозе. Напротив, значения изучаемых показателей при дозе 450 Дж/см2 (менее интенсивная дегрануляция тучных клеток, снижение содержания гормонов) позволяют сделать вывод об ослаблении функциональной активности как мастоцитов, так и щитовидной железы в целом.
В литературе описана дегрануляция тучных клеток в различных тканях как при низкоинтенсивном, так и при высокоинтенсивном лазерном воздействии [11, 12, 13], однако при этом высокоинтенсивное лазерное воздействие сопровождалось термическим повреждением тканей. Локальный нагрев ткани до температур, вызывающих коагуляцию белков, и выше являлся тем физическим фактором, который приводил к дегрануляции мастоцитов. Было показано, что охлаждение ткани во время высокоинтенсивного лазерного воздействия снижало дегрануляцию тучных клеток [14]. Использованный нами режим лазерного воздействия не вызывал термического повреждения тканей щитовидной железы, поэтому причиной наблюдаемого торможения дегрануляции мастоцитов, видимо, являлось превышение критических доз лазерной энергии в глубине тканей. Известно, что стимулирующие эффекты наблюдаются при дозах лазерной энергии, не превышающих 5 Дж/см2, а большие дозы обладают ингибирующим действием, однако это показано только для поверхностных ран и культур тканей [15]. По мере продвижения лазерного излучения в глубину ткани происходит рассеивание и поглощение фотонов, поэтому доза энергии, реально получаемая клетками, несопоставима с дозой на поверхности кожи [2].
Изменение микроциркуляции щитовидной железы при лазерном воздействии может происходить за счет процессов, связанных с локальным синтезом оксида азота [1, 4]. Непосредственным воздействием лазера на усиление дегрануляции тучных клеток с выбросом медиаторов и цитокинов, таких как гепарин, гистамин, ферменты, факторы роста, можно объяснить усиление кровотока щитовидной железы, что является одним из условий активации синтеза йодсодержащих гормонов тиреоидным эпителием [8, 12, 14].
Эффекты лазерного воздействия обусловлены поглощением фотонов митохондриальными и мембранными хромофорами, соответствующими длине волны лазера, изменениями в окислительно-восстановительном потенциале клетки и процессами с участием вторичных мессенджеров, запускающих каскады внутриклеточной сигнализации [15, 16]. В частности, усиление дегрануляции тучных клеток после лазерного воздействия традиционно связывают с повышением внутриклеточной концентрации ионов кальция [11], следовательно, спад функциональной активности мастоцитов может быть связан со снижением проницаемости клеточных мембран для кальция, например из-за нарушения работы кальциевых каналов при воздействии высоких доз лазерной энергии.
ВЫВОДЫ
Моделирование гипотиреоза введением тиамазола изменяет содержание циркулирующих в сыворотке крови ТТГ, Т4 и Т3, однако не влияет на функциональную активность стромальных тучных клеток щитовидной железы: их реакция заметна только в период восстановления, после прекращения дачи препарата.
Воздействие лазера на щитовидную железу является дозозависимым и проявляется стимуляцией функциональной активности как тучных клеток, так и гормонпродуцирующей ткани щитовидной железы. Повышение функциональной активности мастоцитов и нормализация содержания гормонов в сыворотке крови у животных с экспериментальным гипотиреозом отмечена при инфракрасном лазерном воздействии с суммарной плотностью дозы 112 Дж/см2. Тормозящие эффекты наблюдаются при дозе 450 Дж/см2.
Учитывая полученные нами результаты, лазерное инфракрасное воздействие с суммарной плотностью дозы на поверхности кожи 112 Дж/см2 может быть дополнительно изучено с точки зрения возможности его использования для терапии гипотиреоза.