ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Оценка значимости определения количества miR-146a в плазме крови человека для диагностики колоректального рака
Информация об авторах
1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск
2 Городская больница № 40, Санкт-Петербург
3 Городская клиническая больница № 1, Новосибирск
4 Новосибирский государственный медицинский университет, Новосибирск
5 Новосибирский государственный университет, Новосибирск
Для корреспонденции: Максим Леонидович Филипенко
Пр-т Ак. Лаврентьева, д. 8, г. Новосибирск, 630090; ur.csn.hcobin@xam
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 гг.» (Соглашение № 14.604.21.0101, идентификатор RFMEFI60414X0101).
Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений.
Статья получена: 25.08.2017
Статья принята к печати: 30.08.2017
Опубликовано online: 30.10.2017
|
Колоректальный рак — одно из самых распространенных онкологических заболеваний и наиболее часто встречающаяся форма злокачественных опухолей кишечника. При выявлении заболевания на стадии I и адекватной терапии выживаемость пациентов составляет 90 %, тогда как для пациентов со стадией IV — не более 6 %. В связи с этим своевременная диагностика — залог сохранения жизни пациенту. Одним из перспективных направлений исследований является поиск неинвазивных молекулярных маркеров, обнаруживаемых в крови, кале и других доступных биоматериалах.
В 2008 г. Tewari и соавт. обнаружили, что некоторые микроРНК присутствуют в плазме крови человека в удивительно стабильной форме, которая защищает их от действия эндогенных РНКаз [1]. Это стало отправной точкой начала исследований циркулирующих микроРНК в качестве потенциальных биомаркеров. МикроРНК обнаружены в плазме крови, слюне, моче, желчи, грудном молоке и других жидкостях организма человека. Накоплены многочисленные данные о специфическом изменении профиля экспрессии циркулирующих микроРНК при различных патологических состояниях, таких как онкологические, сердечно-сосудистые, воспалительные заболевания, старение и др. [2, 3, 4, 5].
Для опухолей различного происхождения характерны как специфические, так и неспецифические изменения экспрессии микроРНК. Например, большинство опухолей ассоциировано с увеличением экспрессии микроРНК miR-21 и снижением экспрессии микроРНК семейства let-7. Специфическими могут быть изменения для различных гистологических типов новообразований, профилей экспрессии генов в клетках опухоли, стадии TNM.
В исследованиях разных исследователей для колоректального рака значимыми в патогенезе и прогнозе описаны опухоль-специфичные микроРНК miR-21, miR-9, miR-155, miR-17, miR-19, let-7 и miR-24, а также циркулирующие miR-181b, miR-21, miR-183, let-7g, miR-17 и miR-126 [6]. Первое исследование изменения профиля экспрессии микроРНК при колоректальном раке, выполненное в 2003 г., показало снижение экспрессии опухоль-супрессорных микроРНК miR-143 и miR-145 и при аденоматозе, и в злокачественных новообразованиях в сравнении с нормой [7]. К настоящему времени описано несколько десятков микроРНК, экспрессия которых изменяется при КРР [8].
Возможность использования мониторинга микроРНК в плазме крови в качестве неинвазивной диагностики КРР была показана в 2008–2009 гг. [9, 10]. Исследования в этой области остаются крайне актуальными и сегодня [11, 12].
Ранее нами были проанализированы данные проекта SysCol (Systems Biology of Colorectal cancer) [13], содержащие результаты профилирования микроРНК с помощью секвенирования нового поколения (next generation sequencing, NGS), в результате чего для miR-146a (ENSG00000253522) было получено статистически значимое увеличение уровня экспрессии в ткани колоректальной аденокарциномы (logFC = 1,742 для изменения экспрессии микроРНК в опухолях против контрольных образцов, скорректированное значение p = 5,57E–79). Целью настоящей работы являлась оценка диагностической значимости определения уровня miR-146a в плазме крови человека для диагностики колоректального рака.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
В исследование были включены пациенты, проходившие обследование по поводу заболевания толстого кишечника в Городской клинической больнице № 1 (Новосибирск), Центре новых медицинских технологий (Новосибирск) и Городской больнице № 40 (Санкт-Петербург). В экспериментальную группу включили 102 человека с аденокарциномой толстой кишки стадий I–III, в контрольную — 100 человек с воспалительными заболеваниями кишечника (хронический колит, неспецифический язвенный колит, болезнь Крона, n = 58) или без патологий (n = 42). Включение в контрольную группу пациентов с воспалением кишечника обусловлено тем, что прогрессия опухоли всегда сопровождается воспалением в прилегающих тканях. Обе группы подробно охарактеризованы в табл. 1 и табл. 2. Исследование было одобрено этическим комитетом Центра новых медицинских технологий в Новосибирске (протокол № 18 от 24.10.2014). Все пациенты дали письменное информированное согласие на участие в эксперименте.
Для исследования получали периферическую кровь. Кровь (около 10 мл) отбирали из вены в пробирки Vacutainer с антикоагулянтом ЭДТА, тщательно, но мягко перемешивали и центрифугировали в течение 10 мин при 1 600 g и комнатной температуре. Полученную плазму (около 4–5 мл) осторожно отбирали, не захватывая осадка, и переносили в пробирки с коническим дном объемом 15 мл. Центрифугировали еще раз, плазму переносили в пробирки объемом 1,5 мл, замораживали и хранили при –80 °С. Для получения пулов объединяли по 50 мкл 10 образцов плазмы из одной группы.
МикроРНК для анализа выделяли из замороженной плазмы крови. Перед этим к каждому образцу добавляли внутренний контроль — синтетическую микроРНК cel-238, 5 x 107 копий на образец. Он позволял следить за качеством экстракции РНК и полимеразной цепной реакции (ПЦР), например за отсутствием в образце ингибиторов реакции. Количество копий cel-238 использовали в качестве нормировочного коэффициента при вычислении количества копий тестируемых микроРНК в образце.
Количество микроРНК определяли при помощи добавления поли-А тракта поли-А-полимеразой и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с детекцией результатов в «реальном времени». Для реакции ОТ использовали праймер, содержащий на 3’-конце 5–6 оснований, комплементарных 3’-концу микроРНК, затем последовательность из 11 тиминов и области для посадки гидролизуемого флуоресцентно меченного зонда и универсального обратного праймера (табл. 3).
Полученные в реакции обратной транскрипции кДНК, разведенные в 5 раз для исключения ингибирования, амплифицировали методом ПЦР с детекцией результатов в «реальном времени» при помощи специфичного прямого и универсального обратного праймеров и универсального зонда. Использовали термоциклер с оптическим блоком для детекции флуоресценции CFX96 (Bio-Rad, США). Схема амплификации: первичная денатурация — 15 мин при 96 °С; амплификационный цикл (х40): денатурация — 10 с при 96 °С, отжиг праймеров — 20 c при 56 °С, элонгация — 10 с при 72 °С, съем сигнала — 10 с. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала 65 мМ Tris-HCl (pH 8,9), 3 мМ MgCl2, 16 мМ (NH4)2SO4, 0,2 мМ dNTP, 300 нМ праймеров и 100 нМ гидролизуемого флуоресцентно меченного зонда, 0,5 ед. акт. Taq-полимеразы с «горячим стартом» (Biosan, ИХБФМ СО РАН) и 2 мкл кДНК.
Представленность микроРНК определяли в условных единицах по калибровочной кривой, построенной на основе 4 последовательных 4-кратных разведений тестовой кДНК, представляющей собой сконцентрированную в 5 раз смесь кДНК 5 случайных образцов (при этом наименьшая концентрация образцов калибровочной кривой принята за 1 усл. ед.). Коэффициент корреляции между ожидаемым и эмпирическим уравнениями калибровочной кривой был не менее 0,99. Эффективность ПЦР рассчитывали как угол наклона калибровочной кривой. Эффективность ПЦР, определенная методом построения калибровочной кривой для miR-146a, составила 82 %, а для cel-238 — 93 %. Во всех случаях измеряемые значения попадали в линейную область калибровочной кривой. Для оценки воспроизводимости значений порогового цикла (Ct) образец кДНК с каждой парой праймеров амплифицировался в двух повторностях. В целом мы старались не проводить измерений при Ct > 37.
Нормальность распределения полученных нормированных значений концентрации микроРНК проверяли с помощью Anderson–Darling Normality Test. Для определения статистической значимости различий значений концентрации микроРНК в группах использовали непараметрический U-критерий Манна–Уитни. Для ROC-анализа воспользовались программным обеспечением Web-based Calculator for ROC Curves [14].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Нами было проведено выделение микроРНК, синтез кДНК и определение концентраций микроРНК miR-146a и cel-238 в индивидуальных образцах плазмы крови и в их пулах. Для удобства мы обозначили опытную группу буквой T, а контрольную — K.
Медиана нормированного уровня miR-146a в условных единицах составила 9,7 в группе Т против 4,65 в группе К при анализе пулов (табл. 4, рис. 1) и 7,6 против 2,5 соответственно при анализе индивидуальных образцов (табл. 4, рис. 2). Уровень miR-146a был достоверно выше как в пулах, так и в индивидуальных образцах пациентов с колоректальным раком.
Для оценки диагностического потенциала теста нами был проведен ROC-анализ, который показал следующие значения: AUC = 0,79, SD = 0,018, оптимальные значения диагностической чувствительности — 47,3 %, специфичности — 91,5 % при выставлении порогового уровня miR-146a 4 условных единицы (рис. 3).
Сравнение группы условно здоровых людей (n = 42) и пациентов с гранулематозным и язвенным колитом (n = 58) показало, что пациенты с воспалительными заболеваниями кишечника имеют повышенный уровень miR-146a в плазме крови (в среднем 3,1 ± 1,61 против 2,33 ± 0,67 соответственно), однако различия менее выраженные и имеют значительно меньшую статистическую значимость (критерий Манна–Уитни, p = 0,01).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Циркулирующие микроРНК как биомаркеры колоректального рака находятся в фарватере поиска новых методов диагностики онкологических заболеваний [15]. Микро РНК miR-146a рассматривалась в этом аспекте только однажды и не показала диагностической значимости [16]. В то же время есть несколько причин для включения этой микроРНК в список потенциальных биомаркеров для диагностики КРР. Ранее рядом авторов было показано, что miR-146a вовлечена в супрессию воспаления посредством угнетения сигнального пути NF-κB [17], по крайней мере — за счет супрессии генов TRAF6 и IRAK1 [18]. Повышенная концентрация miR-146a в плазме крови наблюдается при ряде воспалительных заболеваний, например при сепсисе [19]. Это может быть следствием сверхстимуляции молекулярных механизмов, ограничивающих воспаление. Вместе с тем пока мы не можем определенно указать как типы клеток, так и конкретные молекулярные механизмы, приводящие к увеличению количества miR-146a в циркуляции при некоторых онкологических заболеваниях, в том числе колоректальном раке. Ассоциативные исследования показали, что полиморфный вариант rs2910164 в гене miR-146a ассоциирован с ростом риска развития рака пищеварительной системы различных типов [19, 20], что также обосновывает наш выбор.
В нашем исследовании показана статистически значимая ассоциация (p < 0,0001) повышенной концентрации miR-146a с раком толстого кишечника. Более того, измерение количества miR-146a в пулах показало меньшую, но также статистически значимую ассоциацию. Формирование пулов образцов ранее неоднократно было использовано в качестве метода прескрининга для повышения производительности и снижения стоимости исследований [21, 22, 23]. Однако работ по валидации такого подхода немного. В настоящем исследовании мы показали возможность редукции тестируемых образцов с помощью формирования пулов по 10 образцов плазмы крови для первичного скрининга.
Несмотря на статистически значимое повышенное содержание miR-146a в плазме крови пациентов с колоректальным раком в сравнении с пациентами без этой онкопатологии, ROC-анализ показал довольно умеренный AUC, равный 0,79 ± 0,018, с неудовлетворительной диагностической чувствительностью (47,3 %). Более того, концентрация miR-146a была достоверна повышена и у паци- ентов с воспалительными заболеваниями кишечника, что неудивительно, учитывая важную роль miR-146a в регуляции воспаления. Ранее увеличение количества miR-146 в плазме крови наблюдали у пациентов с аутоиммунным тиреоидитом [24], при сепсисе [19] и других заболеваниях с воспалительным компонентом.
ВЫВОДЫ
По результатам исследования можно сделать вывод о достаточно низкой специфичности изолированной количественной детекции miR-146a в плазме крови как метода диагностики при колоректальном раке. Специфичность и чувствительность использованного подхода могут быть уточнены только в проспективных исследованиях, которых сейчас крайне мало. Вместе с тем функциональная связь miR-146a, воспаления и колоректального канцерогенеза, а также высокая значимость полученной ассоциации повышенной концентрации miR-146a в плазме крови и КРР, делают эту микроРНК кандидатом на включение в состав диагностических профилей на основе нескольких микроРНК с улучшенной специфичностью.