Первым шагом в борьбе с инфекционным заболеванием является быстрое и точное определение одного или нескольких патогенов, являющихся причиной инфекции. Идентификация возбудителей способствует выбору надлежащей антибиотикотерапии не только при клинических синдромах, таких как сепсис, но также и в случае инфекций, вызванных множественными патогенами, например инфекций верхних дыхательных путей.

Как правило, методы идентификации и выявление устойчивости патогенных микроорганизмов к антимикробным препаратам в большинстве микробиологических лабораторий основаны на культивировании микроорганизмов. Такие подходы затратны по времени и не всегда эффективны для труднокультивируемых микроорганизмов и для микроорганизмов с ослабленной жизнеспособностью, например в результате лекарственной терапии. Современное молекулярное тестирование позволяет идентифицировать большое число патогенов с высокой специфичностью и чувствительностью напрямую из клинических образцов [1].

Перечень выявляемых с помощью доступных тест-систем возбудителей ограничен наиболее частыми бактериальными видами, поэтому иногда мы наблюдаем признаки инфекции при наличии отрицательных результатов культуральных и молекулярно-генетических тестов. Для таких случаев еще в начале 1990-х гг. был предложен подход, включающий амплификацию на ДНК клинического образца или чистой бактериальной культуры фрагмента гена, кодирующего 16S рРНК, определение его нуклеотидной последовательности и идентификацию бактерии на основании анализа полученной последовательности, а также ее сравнения с последовательностями, описанными для известных патогенов [2].

Использование гена 16S рРНК в качестве мишени для идентификации бактерий возможно за счет его наличия у всех бактерий и его высокой консервативности [3]. Высококонсервативные участки перемежаются вариабельными областями, их комбинации видоспецифичны. Амплификация гена 16S рРНК выполняется с помощью олигонуклеотидных праймеров, соответствующих консервативным участкам гена [4]. Бактерии могут быть идентифицированы путем анализа нуклеотидной последовательности продукта полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим сравнением этой последовательности с известными последовательностями, хранящимися в базе данных, например RiboDB. К настоящему времени описаны десятки тысяч нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК разнообразных бактериальных видов.

Амплификация и секвенирование гена 16S рРНК возможны для ДНК, полученной как из клинических образцов, так и из бактериальных изолятов, в тех случаях, когда список потенциальных возбудителей достаточно длинный. Метод также может быть применен для обнаружения бактерий, которые трудно культивировать, или при работе с клиническими образцами от пациентов, получавших антибиотики [5, 6, 7]. Некоторые исследователи использовали его для анализа образцов спинномозговой жидкости, гноя, жидкости в суставах и тканей [8]. Например, Xia и соавт. [9] секвенировали ген 16S рРНК одновременно с проведением стандартного анализа бактериальной культуры для выявления инфекционных агентов у пациентов с пневмониями. С помощью секвенирования были идентифицированы бактерии родов Prevotella, Proteus, Aquabacter и Sphingomonas, которые не были обнаружены при стандартном исследовании. Бактерии 7 видов — Streptococcus, Neisseria, Corynebacterium, Acinetobacter, Staphylococcus, Pseudomonas и Klebsiella — были обнаружены обоими методами, но метод секвенирования гена 16S рРНК обладал значительно большей чувствительностью при обнаружении бактерий родов Streptococcus и Pseudomonas. В работе Daroy и соавт. [10] секвенирование гена 16S рРНК позволило выявить бактерии Haemophilus influenzae, Sphingomonas sp., Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus haemolyticus, Morganella morganii, Mycobacterium sp., Chryseobacterium sp., Pseudomonas saccharophila (Xanthomonas) и грибы Phaeoacremonium inflatipes в 19 образцах слезной жидкости пациентов с инфекциями глаз, хотя для всех из них были получены отрицательные результаты при культуральном исследовании.

Нами описан клинический случай идентификации патогена, вызвавшего абсцесс головного мозга, амплификацией и секвенированием гена 16S рРНК.

Описание клинического случая

В Детской городской клиническлй больнице № 9 им. Г. Н. Сперанского (Москва) с 6 июня по 15 июля 2016 г. находилась на стационарном лечении девочка в возрасте 14 лет 11 мес. с диагнозом «абсцесс головного мозга». Отсутствие лихорадки до и в течение периода госпитализации и постоянные аллергические реакции на различные антибиотики затрудняли как диагностику инфекции (в связи с этим ребенок был достаточно поздно госпитализирован), так и терапию.

С января 2016 г. девочку беспокоили боли в правом ухе, с 25 мая она перенесла правосторонний острый средний катаральный отит. После вызова бригады скорой медицинской помощи была доставлена в стационар из-за тошноты и рвоты, не лихорадила. На следующий день развились ригидность затылочных мышц и симптомы Кернига, верхний и нижний симптомы Брудзинского и атаксия. Была проведена компьютерная томография головного мозга, которая выявила абсцесс правой гемисферы с перифокальным отеком.

7 июня ребенку была выполнена трепанация черепа, дренирование абсцесса головного мозга правой теменной области, удалено 2 мл гноя, поставлен дренаж, назначена антибиотикотерапия. После введения ванкомицина развилась аллергическая сыпь, и препарат был отменен с заменой на комбинированную антибиотикотерапию меропенемом в дозе 2 г/сут. и линезолидом в дозе 600 мг каждые 12 ч. 9 июня возникла аллергическая реакция на линезолид: тошнота, рвота, затруднение дыхания. Этот препарат был заменен на амикацин в дозе 400 мг дважды в день. 13 июня был удален дренаж, а с 19 июня попросьбе матери ребенка было прекращено введение меропенема из-за аллергических реакций.

21 июня была проведена контрольная КТ с контрастным усилением, которая выявила рецидив абсцесса в смежных отделах головного мозга. Был назначен цефепим в дозе 2 г трижды в день и метронидазол внутривенно по 0,5 г/сут. В тот же день была проведена повторная операция, при которой было эвакуировано 20 мл гноя. Ребенок не лихорадил. Отделяемого по дренажу не было. 25 июня — снова операция, эвакуировано 12 мл гноя. Субфебрилитета не было. К цефепиму и метронидазолу был добавлен ванкомицин, а с 30 июня — цефомакс в дозе 2 г трижды в день вместо цефепима. Таким образом, за время нахождения в стационаре ребенку были выполнены 3 операции по удалению содержимого абсцесса.

Четыре посева гноя из абсцесса не показали роста культуры ни в одном случае. Результаты биохимических анализов крови с определением содержания C-реактивного белка и скорости оседания эритроцитов приведены в таблице.

Дважды, 14 и 22 июня, на ДНК и кДНК из содержимого абсцесса головного мозга был проведен ПЦР-анализ для определения вируса простого герпеса I и II типа, цитомегаловируса, вируса Эпштейн–Барра, вируса просто герпеса VI типа, энтеровирусов, Toxoplasma gondii, Streptococcus pyogenes, Neisseria meningitidis, Haemophilus influenza, Streptococcus pneumoniae, метициллин-чувствительных и метициллин-резистентных штаммов Staphylococcus  aureus, метициллин-резистентных коагулонегативных штаммов S. aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, C. glabrata, C. krusei и Streptococcus spp. Оба раза результаты были отрицательными. При этом внутренним контролем в данном наборе реагентов служил ген актина, и по этой мишени кривая амплификации пересекала линию трешхолда при Ct = 23,39, что свидетельствовало о нормальном качестве ДНК, экстрагированной из гноя.

Образец ДНК был передан в лабораторию фармакогеномики Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН для амплификации фрагмента гена 16S РНК. В результате секвенирования была получена нуклеотидная последовательность, включавшая высоковариабельные участки гена v2–v4. Сравнительный анализ полученной нуклеотидной последовательности с использованием программы BLAST (NCBI, США) показал высокую гомологию (99 %) с последовательностью гена 16S рРНК бактерии Streptococcus intermedius (штамм ChDC B589, KF733728.1).

Обсуждение клинического случая

В научной литературе и международных клинических рекомендациях описана роль комменсала Streptococcus intermedius в развитии абсцессов головного мозга [11]. Также описан случай абсцесса ГМ у пожилой женщины, посевы аспирата из которого не приводили к росту культуры, а инфекционный агент, как и в описываемом нами случае, был установлен с помощью секвенирования гена 16S РНК [12]. Streptococcus intermedius и Streptococcus constellatus составляют группу, которую в зависимости от применяемой классификации иногда называют Streptococcus milleri group, демонстрируют серологическое и гемолитическое разнообразие, обладают разной иммуногенностью. Вероятно, S. intermedius в данном случае не запускал развитие адекватного иммунного ответа у пациентки, что приводило к отсутствию как лихорадки, так и маркеров воспаления (таблица). Соответственно, никакие методы лабораторной диагностики, имеющиеся в распоряжении многопрофильного стационара, не могли помочь в установлении этиологии заболевания, кроме примененного нами секвенирования по Сэнгеру.

Ошибочные результаты ПЦР-анализа были связаны, вероятно, с отсутствием данного референсного штамма у разработчиков использованного набора реагентов. Терапия ex juvantibus против S. intermedius, начатая еще до получения результатов секвенирования, привела к положительной динамике и купированию процесса у ребенка, что стало косвенными подтверждением данных секвенирования. Таким образом, описанный клинический случай указывает на то, что в случае дискордантных результатов двух молекулярных методов — ПЦР и секвенирования по Сэнгеру — стоит опираться на второй как на «золотой стандарт» в молекулярной биологии.

ВЫВОДЫ

Амплификация и полное секвенирование гена 16S рРНК или секвенирование его фрагментов непосредственно из клинических образцов имеет свои ограничения. В качестве образца для анализа является предпочтительным материал из стерильных локусов. При полимикробных инфекциях или взятии материала из нестерильных локусов обычно возникают трудности с интерпретацией результатов секвенирования. Кроме того, даже получение ампликона ДНК микроорганизма из клинического образца необязательно свидетельствует о том, что именно идентифицированный организм является возбудителем инфекции. Секвенирование гена 16S рРНК — трудоемкая процедура, требующая хорошего оснащения лаборатории и высокой квалификации персонала. Тем не менее в отдельных случаях данный метод может являться практически единственным способом идентификации потенциального патогена. В приведенном клиническом случае секвенирование гена 16S рРНК позволило выявить нетипичный бактериальный вид, а анализ доступных литературных данных позволил предположить его этиологическую роль в развитии абсцесса мозга и предположить причины нетипичного течения заболевания.