Эпоха антибиотиков: от побед к поражениям

Еще в начале 19 в. общераспространенной была точка зрения, что основной причиной заболеваний является нарушение равновесия в организме, и только в середине 19 в. Луи Пастер показал, что инфекционные заболевания возникают в результате негативного воздействия микроорганизмов. В 1928 г. произошло эпохальное для медицины событие: британским бактериологом Александром Флемингом был обнаружен первый антибиотик пенициллин. Это положило начало эпохе антибиотиков, которые поначалу представлялись «лекарством от всех бед», супероружием, способным переломить ход борьбы человечества с инфекциями. Однако эйфория была недолгой. Углубление знаний о бактериях привело к появлению большого числа антибиотиков, разнообразных по механизму и широте спектра действия и химическим свойствам, но бактерии ответили на это развитием антибиотикорезистентности, сводящей на нет все усилия ученых и врачей [1]. Надежды возлагались на антибиотики последнего резерва, такие как колистин и даптомицин.

В мае 2015 г. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) признала резистентность к антибиотикам причиной кризиса современной медицины и предложила Глобальный план борьбы с устойчивостью к противомикробным препаратам [2]. Однако уже в ноябре 2015 г. появилось сообщение об обнаружении гена трансмиссивной устойчивости к колистину [3], а в октябре 2016 г. — об обнаружении золотистого стафилококка (Staphilococcus aureus), устойчивого к даптомицину за счет снижения активности антибиотика посредством выделения во внешнюю среду мембранных фосфолипидов, в мицеллы которых встраивается даптомицин [4]. Чуть раньше, в сентябре 2016 г., одна американская пациентка умерла от сепсиса, вызванного грамотрицательной «супербактерией» Klebsiella pneumoniae, устойчивой ко всем 26 антибиотикам, разрешенным в США [5]. В докладе [6], опубликованном через год, ВОЗ, проанализировав известные антибиотики и их комбинации, используемые в клинической практике, пришла к выводу, что отсутствует потенциальная возможность лечения инфекций, вызываемых грамотрицательными бактериями, обладающими множественной лекарственной устойчивостью. Таким образом, казавшийся надежным барьер — антибиотики последнего резерва — пал, и привычные инфекции снова могут убивать как раньше. Очевидно, что остро встают проблемы получения принципиально новых антибиотиков или разработки альтернатив антибиотикам, способных сравниться с ними по эффективности.

Получение новых антибиотиков

Антибиотики — вещества природного, полусинтетического или синтетического происхождения, в малых концентрациях подавляющие жизненные процессы микроорганизмов. Получение антибиотиков осуществляется либо поиском антибиотиков среди актиномицетов (реже — среди немицилярных бактерий), либо перебором химических структур с последующим моделированием расположения (молекулярным докингом) перспективной структуры в активном центре предполагаемой мишени.

В настоящий момент получение новых антибиотиков практически приостановлено по нескольким причинам. Во-первых, мишень большинства антибиотиков — это один из трех ключевых прокариотических метаболических путей или процессов, а именно: 1) биосинтез белка, 2) репликация ДНК, 3) биосинтез клеточной стенки бактерий [7]. Большинство принципиально новых подходов к данным мишеням были найдены ранее. Кроме того, спонтанные мутации бактерий могут за несколько дней уничтожить труд нескольких лет работы научно-исследовательской лаборатории, что делает подобный подход очень рискованным и дорогостоящим. Во-вторых, примерно один миллион новых актиномицетов необходимо проанализировать, чтобы найти всего лишь один новый антибиотик [8], и это сильно удорожает исследования.

Более 90 % всех видов бактерий, обнаруженных во внешней среде, являются некультивируемыми в обычных лабораторных условиях [9], но в настоящее время стало возможным создание специальных условий для их культивирования и поиска среди них продуцентов новых антибиотиков. В связи с этим возникли две принципиально различные стратегии поиска новых антибиотиков: поиск антибиотиков среди «некультивируемых» бактерий и создание принципиально новых искусственных молекул антибиотиков. Обе стратегии уже дают результаты. Так, при скрининге некультивируемых почвенных бактерий был обнаружен новый антибиотик тейксобактин, действующий на грамположительные микроорганизмы [10]. Также был синтезирован новый антибиотик PEG-2S, являющийся ингибитором переносящей Na⁺ НАДН-убихинон-оксидоредуктазы [11].

Особенно перспективно применение синтетических антибиотиков, нацеленных на бактериальную биоэнергетику [12]. Так, в 2012 г. впервые за четыре десятилетия поисков был получен и разрешен к применению Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) антибиотик бедаквилин для лечения туберкулеза, особенностью которого является нацеленность на АТФ-синтазу микобактерий: клетки с угнетенной биоэнергетикой погибают [13].

Также на основе симбиотической теории было выдвинуто предположение, что митохондриально направленные антиоксиданты, снижающие потенциал мембраны митохондрий, могут являться эффективными антибиотиками, и это предположение нашло подтверждение на практике: было обнаружено новое свойство митохондриально направленного антиоксиданта SkQ1, синтетического производного трифенилфосфония, убивать бактерии за счет снижения их мембранного потенциала [14, 15].

Альтернативы антибиотикам

Несмотря на довольно большое разнообразие подходов к получению эффективных альтернатив антибиотикам и их изучение на протяжении более чем десяти лет, ярких прорывов в лечении инфекций с их помощью не произошло. Лишь некоторые альтернативы антибиотикам являются таковыми, что связывают прежде всего с по-прежнему более высокой эффективностью антибиотикотерапии.

Наиболее интересными альтернативами являются: вакцины, антитела, пробиотики, иммуностимуляторы, фотосенсибилизаторы, бактериофаги, фаголизины, искусственные бактериофаги, антимикробные пептиды, пептиды, защищающие хозяина, антибиопленочные соединения, ингибиторы помп множественной лекарственной устойчивости, иммуносупрессанты, липосомные ловушки для токсинов, хелаторы металлов, антибактериальные нуклеиновые кислоты, противорезистентные нуклеиновые кислоты, противобактериальные пептиды. Этот список не является исчерпывающим.

Основываясь на оценке клинического потенциала и относительной простоты применения, можно сказать, что наибольшим потенциалом в качестве альтернативы антибиотикам обладают фаголизины и ингибиторы помп множественной лекарственной устойчивости — как терапевтические агенты, вакцины и антитела — для профилактики и пробиотики — для лечения и профилактики. Большим потенциалом обладают также бактериофаги и антибиопленочные соединения, антимикробные пептиды и фотосенсибилизаторы, однако их появление на рынке готовых препаратов для замены антибиотиков пока остается под вопросом. Значение имуностимуляторов, уже используемых для профилактики заболеваний и в качестве дополнительных средств при терапии, для клинической практики неясно, поэтому они не выглядят полноценной заменой антибиотикам.

Многие из вышеперечисленных подходов находятся на этапе экспериментальных исследований или даже разработаны только теоретически. Больше информации о большинстве из них можно найти в обзоре [16], написанном исследователями из академических и промышленных кругов по заказу фонда Wellcome Trust (Великобритания). В данном обзоре рассматриваются наиболее перспективные и интересные альтернативы антибиотикам, такие как вакцины, антитела, ингибиторы помп множественной лекарственной устойчивости, фотосенсибилизаторы, бактериофаги и фаголизины.

Вакцины

Вакцины являются одним из наиболее разработанных подходов с большим профилактическим потенциалом. В 2015 г. в Великобритании начала применяться мультикомпонентная вакцина Bexsero (GlaxoSmithKline Biologicals, Великобритания) против бактерии Neisseria meningitidis, возбудителя детского менингита и бактериемии. Из-за того, что капсулярный полисахарид MenB, определяющий вирулентность бактерии, похож на молекулы клеточной адгезии человека, получение эффективных антител к менингококкам является непростой задачей. Она была решена за счет биоинформатического поиска потенциального антигена, который затем в составе частиц наружной менингококковой мембраны оказался способен давать иммунный ответ при вакцинации. Данный подход называется обратной вакцинологией (reverse vaccinology), и полученная британцами вакцина эффективна против 73–88 % штаммов менингококков группы В (MenB) [17]. Однако замена антибиотиков подобными вакцинами в настоящее время маловероятна.

Антитела

Наряду с антибиотиками краеугольным камнем современной медицины являются антитела, которые обладают широким спектром уникальных свойств. Существуют две концепции их применения: 1) патоген-специфичные мноклональные антитела используются самостоятельно для предотвращения развития инфекции или 2) в комбинации с антибиотиками для лечения бактериальных инфекций [18]. Антитела используются как анатоксины для нейтрализации эффектов бактериальных токсинов [19, 20, 21, 22], а также могут быть направлены на бактериальные антигены [23, 24, 25] и сигналы чувства кворума [26, 27]. Использование антител в комбинации со стандартными антибиотиками открывает возможности для подавления развития биопленок, что повышает эффективность антибиотикотерапии, и для борьбы с популяцией клеток-персисторов, не чувствительных к антибиотикам [28, 29].

Ингибиторы помп множественной лекарственной устойчивости

Этот подход использовался ранее, но в настоящее время ему уделяется пристальное внимание [30, 31] в связи с особенностями взаимодействия субстратов помп множественной лекарственной устойчивости и их ингибиторов [15, 32]. Этот подход является принципиально новым и не описан в обзоре [16]. Он позволяет снизить терапевтическую концентрацию антибиотиков на 1–2 порядка. Впервые это было показано на антибиотике SkQ1, где удаление помпы приводило к снижению минимальной ингибирующей концентрации примерно в 50 раз. К сожалению, все осложняется тем, что обычно в выкачке антибиотиков участвует не одна помпа, а ингибиторы часто действуют на множество помп одновременно. Тем ценнее тот факт, что антибиотик SkQ1 является уникальным для основной помпы множественной лекарственной устойчивости Escherichia coli — AcrAB-TolC [15]. Несомненно, применение ингибиторов помп множественной лекарственной устойчивости во многом снимает проблему резистентности бактерий к антибиотикам.

Фотосенсибилизаторы

Антимикробная фотодинамическая терапия и антимикробная фотодинамическая инактивация (aPDT и aPDI) являются новыми эффективными способами уничтожения грамотрицательных и грамположительных бактерий и дрожжей [33, 34, 35, 36]. aPDI является нетермической реакцией, вызываемой взаимодействием квантов видимого света с фотосенсибилизаторами (метиленовый синий, хлорины, порфирины, хлорофиллы и их производные) в присутствии кислорода. Активные формы кислорода, возникающие при этом по механизму I или II (рис. 1), эффективно уничтожают бактериальные клетки, включая клетки Pseudomonas aeruginosa. Данная терапия особенно эффективна в стоматологии и дерматологии [36], где способна заменить антибиотики «местного действия».

Фаговая терапия

Вирусы бактерий (бактериофаги) — крупнейшая из известных групп вирусов, содержащих преимущественно двухцепочечную геномную ДНК, хотя встречаются небольшие группы фагов с одноцепочечной ДНК, а также с двух- и одноцепочечной РНК [37]. В мире насчитывается примерно 10³¹–10³² фагов [38], и они играют важную роль в регуляции мировой популяции бактерий. Так, бактериофаги ответственны за гибель 20–40 % морских бактерий ежедневно [39]. Использование фагов в качестве лечебных препаратов было предложено и успешно испытано Твортом [40], Д'Эрелем [41] и Брийоном и Майсином [42] в начале 20 в. Использование фагов в качестве лечебных препаратов не нашло своего распространения в связи с успехами антибиотикотерапии и нехваткой теоретических данных, которая не позволяла объяснить неудачи клинических испытаний [43].

В соответствии с современными представлениями для лечения бактериальной инфекции фаговыми препаратами должно соблюдаться несколько условий: 1) используемый бактериофаг должен быть литическим; 2) необходимо подбирать титр бактериофага под конкретную инфекцию; 3) фаговый рецептор должен быть известен; 4) препарат фага должен быть свободен от бактерий и 5) должен содержать живые частицы бактериофага [44, 45, 46]. При этом эффективность фаговой терапии, т. е. снижение количества патогенных бактерий до уровня, с которым уже может справиться защитная система организма [47], зачастую является индивидуальным параметром наряду с другими факторами, что препятствует выходу фаговых препаратов на рынки Европы и США [46].

Бактериофаги, так же как и антибиотики, напрямую уничтожают бактерии, поэтому можно сравнивать их эффективность. Без сомнения, бактериофаги более специфичны к конкретным штаммам бактерий, что может быть положительной стороной их использования, например в случае с антибиотик-ассоциированной диареей и инфекцией, вызванной Clostridium difficile [48]. При этом фаговая терапия наносит значительно меньший ущерб организму, чем антибиотикотерапия [49, 50]. Однако в условиях, когда инфекция вызвана рядом разных бактерий, как это происходит при раневых инфекциях, бактериофаги значительно уступают антибиотикам в эффективности [51].

Перекрестное заражение бактерий E. coli бактериофагами, полученными в Мексике и Бангладеш, географически удаленных регионах, показало высокую специфичность фагов к бактериям из своего региона [52]. Попытки же применить коктейль бактериофагов, производимый в России, в отношении когорты из 160 детей из Бангладеш, страдавших от диареи, вызванной кишечной палочкой, не выявил отличий в сравнении с плацебо [53]. При этом бактериофаги, поражающие антибиотикорезистентные бактерии, легче всего обнаруживаются в местах, где антибиотикорезистентные бактерии были получены [54]. Эти данные позволяют под другим углом посмотреть на проблему антибиотикорезистенности и применения фаговой терапии для лечения.

Применение бактериофагов для лечения инфекций, обычно вызываемых бактериями, образующими биопленки, представляется довольно интересным. В этом случае антибиотики недостаточно эффективны: только высокие и токсичные дозы антибиотиков способны останавливать рост биопленок [55]. Применение же бактериофагов in vitro не только препятствует формированию биопленок, но приводит к полному уничтожению биопленок, образованных бактериями Listeria monocytogenes, P. aeruginosa и Staphylococcus epidermidis [56, 57].

Для оценки возможных осложнений во время фаговой терапии необходимо знание как нюансов биологии, так и полного генома бактериофага, т. к. некоторые фаги могут содержать гены факторов вирулентности или токсинов [58], а также гены антибиотикорезистентности [59, 60, 61, 62]. Существование фаг-ассоциированных токсинов ботулизма [59], дифтерии [58], холеры [63], а также возможная конверсия нетоксичной бактерии в токсичную под действием фага, кодирующего токсины [64], делает фаговую терапию более сложной, чем использование антибиотикотерапии. Считается, что жизненные циклы бактериофагов (рис. 2) могут варьировать от литических до лизогенных через различные вариации псевдолизогенных и критических (дефектных) жизненных циклов [65, 66], а анализ геномов гигантских бактериофагов P. aeruginosa [67, 68, 69] показал, что продукты ряда генов имеют большое сходство с не охарактеризованными по функции белками различных организмов.

Таким образом, сложные жизненные циклы, потенциальная опасность конверсии и переноса генов резистентности, изменчивость как самих бактериофагов, так и мутации в бактериальной популяции делают фаговую терапию довольно нестабильной, что подтверждается недостаточным распространением этой потенциально эффективной альтернативы антибиотикам.

Литические ферменты бактериофагов (фаголизины)

Клеточная стенка бактерий — барьер, который ДНК любого бактериофага обязана преодолеть, чтобы инфицировать бактерию и уже в виде готовой вирусной частицы выйти из нее. Клеточная стенка бактерий является сложноорганизованной и упорядоченной системой липидных и пептидогликановых слоев, затрудняющих попадание чужеродных веществ внутрь бактериальной клетки. По своему составу она бывает трехслойной (грамотрицательный тип) и двухслойной (грамположительный тип). Трехслойная клеточная стенка состоит из внутренней (плазматической) мембраны, пептидогликанового слоя и наружной мембраны [70, 71], а двухслойная — лишена наружной мембраны.

Наиболее сложным для проникновения является пептидогликановый слой, который построен из чередующихся и соединенных посредством β-1,4-гликозидных связей остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты с присоединенным пептидным фрагментом. Сшитые между собой блоки пептидогликанов (муреин) образуют, по существу, единую гигантскую макромолекулу, которая определяет прочность пептидогликанового слоя и его непроницаемость для вирусных частиц и токсических факторов большой массы [37, 70, 71]. Таким образом, для проникновения фаговой ДНК внутрь клетки фагу необходимо локально нарушить целостность как клеточных мембран, так и пептидогликанового слоя. Задачу разрушения пептидогликанового слоя берут на себя литические ферменты, которые в литературе получили название лизинов бактериофагов (фаголизины, эндолизины или виролизины).

Необходимо отметить, что в процессе инфицирования бактерии происходят 2 акта лизиса пептидогликанового слоя [72]: «лизис извне» и проникновение ДНК фага и «лизис изнутри» и выход новых фаговых частиц. Обычно «лизис извне» осуществляется ассоциированным с капсидом фаголизином, например у бактериофага Т4 это структурный белок базальной пластинки gp5, который содержит функциональный домен, обладающий свойствами фаголизина [73, 74]. При этом «лизис извне» является точечным и ограничен в пространстве и времени, чтобы фаговая ДНК могла проникнуть в клетку, но при этом фаг не убил ее. «Лизис изнутри» обычно осуществляется растворимым фаголизином и ,в противоположность «лизису извне», не ограничен в пространстве, но четко привязан ко времени. Он осуществляется после масштабного синтеза фаголизина в клетке и запускается одновременно с синтезом и встраиванием в мембрану специального регуляторного белка «холина» (от hole — дыра), образующего неселективные поры в бактериальной мембране. Эти поры нарушают метаболизм бактерии и одновременно открывают фаголизинам доступ к пептидогликановому слою, тем самым вызывая его тотальный лизис с последующим разрушением клетки и выходом фаговых частиц наружу [75, 76, 77].

Очевидно, что с точки зрения замены антибиотиков растворимые фаголизины, осуществляющие масштабный «лизис изнутри», представляют особый интерес, т. к. способны эффективно лизировать пептидогликан и, в отличие от фага, не требуют регуляторного белка «холина».

Существует несколько классификаций фаголизинов [78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85], наиболее интересной из которых является классификация по механизму действия: 1) лизоцимподобные мурамидазы (гидролизуют β1–4-связь между остатками N-ацетилмурамовой кислоты и N-ацетилглюкозамином в молекуле пептидогликана; подразделяются на мурамидазы и литические трансгликозилазы); 2) N-ацетилмурамоил-L-аланин-амидазы (гидролизуют амидную связь между N-ацетилмурамовой кислотой и L-аланином); 3) пептидазы (гидролизуют пептидную связь между аминокислотами пептидогликана) и 4) эстеразы (рис. 3).

При изучении автолитических ферментов пневмококков S. pneumoniae было обнаружено, что фаголизины имеют модульное строение, где один домен узнает место лизиса, а другой — производит расщепление пептидогликана [86]. Модульное строение оказалось свойственно как новым, так и ранее открытым фаголизинам [87, 88, 89], а генно-инженерные эксперименты по комбинированию и перестановке функциональных доменов стали подтверждением этого факта [90].

Конечно, не все фаголизины имеют одинаковый терапевтический потенциал, однако ряд свойств, например свойство фаголизина PlySs2 после 10 последовательных этапов заморозки и оттаивания сохранять свою функциональность [91] и свойство фаголизина PlyG атаковать эндоспоры бацилл Bacillus anthracis [92], делает фаголизины интересным и перспективным объектом исследований. Еще одним интересным свойством фаголизинов является их видоспецифичность, т. е. они способны убивать только те виды или подвиды бактерий, против которых направлены их фаги [93, 94].

Простота генно-инженерных манипуляций и модульное строение позволили создать комбинации гибридных фаголизинов для лечения сложных бактериальных инфекций, вызываемых метицилин-резистентным штаммом S. aureus (MRSA) [95], а комбинации с низкомолекулярными антибиотиками, например фаголизина Cpl-1 и пенициллина или гентамицина, могут приводить к полному уничтожению пневмококков пенициллин-устойчивого штамма [96].

Однако отсутствие фаговой «машинерии», позволяющей проникать сквозь сложную бактериальную стенку, ограничивает применение фаголизинов. У грамотрицательных бактерий внешняя мембрана снижает эффективность терапии почти до нуля [94], тогда как в отношении грамположительных бактерий она остается высокой. Также остается опасность выработки антител к фаголизинам, препятствующих их работе. Было показано, что in vitro и in vivo антитела замедляют, но не полностью блокируют лизис бактериальных клеток [97], что может объясняться тем, что аффинность фаголизинов к своим субстратам может быть выше, чем аффинность антитела к ферменту.

ВЫВОДЫ

Несмотря на большое число потенциально перспективных альтернатив, ни одну из них нельзя назвать полноценной заменой антибиотикам. Все они уступают в чем-либо: безопасности, предсказуемости лечения, масштабируемости, управляемости, простоте и эффективности лечения. При этом очевидно, что развитие альтернативных подходов к антибактериальной терапии — насущная потребность современного здравохранения. По всей видимости, наиболее перспективными окажутся смешанные подходы антибиотикотерапии и альтернатив антибиотикам, где за счет синергии будет достигаться эффект, превосходящий таковой от антибиотикотерапии и альтернативного метода лечения по отдельности.