DOI: 10.24075/vrgmu.2018.001

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Исследование клонального репертуара фракции активированных Т-лимфоцитов у пациента с анкилозирующим спондилитом

Е. А. Комеч, Ю. Б. Лебедев, А. В. Кошенкова, Д. С. Сырко, Е. А. Мусаткина, С. А. Лукьянов, Д. М. Чудаков, И. В. Звягин
Информация об авторах

Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва

Для корреспонденции: Звягин Иван Владимирович
ул. Островитянова, д. 1, г. Москва, 117997; moc.liamg@nigayvzi

Информация о статье

Финансирование: работа поддержана Министерством образования и науки РФ, идентификатор проекта RFMEFI60716X0158.

Благодарности: авторы выражают признательность пациенту, принявшему участие в исследовании; врачу-гематологу, профессору кафедры гематологии и терапии им. А. А. Максимова Денису Анатольевичу Федоренко из Национального медико-хирургического центра имени Н. И. Пирогова — за консультации по клиническим вопросам; старшему научному сотруднику Елене Ивановне Коваленко из Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова за помощь в осуществлении цитофлуорометрического анализа.

Статья получена: 15.12.2017 Статья принята к печати: 25.12.2017
|

Анкилозирующий спондилит (АС, болезнь Бехтерева) — хроническое ревматологическое заболевание предположительно аутоиммунной природы. Согласно результатам исследований по поиску геномных ассоциаций, риск развития АС связан с определенными аллелями генов системы антиген-презентации (HLA, ERAP1/2), а также аллелями генов ряда рецепторов цитокинов, задействованных в провоспалительных реакциях [1]. Выраженная ассоциация риска развития АС с определенными аллелями гена HLA-B, одного из генов системы антиген-презентации, и наличие протективных вариантов HLA-B лежат в основе гипотезы возникновения АС в результате распознавания Т-клетками собственного антигена организма в комплексе с молекулой HLA-B*27 [2]. Недавние исследования клонального репертуара Т-клеток больных АС позволили определить группу клонов цитотоксических Т-лимфоцитов с высокогомологичной структурой антиген-распознающей части Т-клеточного рецептора (ТКР), специфически обнаруживающихся в периферической крови и синовиальной жидкости пораженных суставов больных АС [3, 4]. Клоны Т-лимфоцитов со сходной и/или идентичной структурой антиген-распознающей части ТКР ранее были найдены в синовиальной жидкости пациентов с реактивным артритом — заболеванием, которое также относится к группе спондилоартропатий [5, 6, 7].

Существенный интерес представляет характеристика функционального состояния клеток клонов Т-лимфоцитов, предположительно связанных с началом и/или поддержанием воспалительного процесса. В настоящей работе мы исследовали клональную структуру и состав фракции активированных Т-лимфоцитов периферической крови пациента с анкилозирующим спондилитом на фоне активного течения заболевания. Для реконструкции клонального репертуара Т-клеток пациента мы применили современную технологию, основанную на секвенировании нового поколения (next-generation sequencing, NGS) библиотек кДНК бета-цепей ТКР, подготовленных с использованием техники молекулярного баркодирования [8, 9], и которая позволяет анализировать клональный состав образца и количественную представленность сотен тысяч отдельных клонов Т-клеток. После реконструкции клонального репертуара Т-лимфоцитов фракции активированных Т-клеток крови и исследования общей структуры репертуара мы провели поиск опубликованных к настоящему времени ассоциированных с АС клонов Т-клеток среди клонотипов исследуемой фракции. Для оценки представленности выявленных клонотипов в общем репертуаре периферической крови и их принадлежности к двум основным функциональным субпопуляциям Т-клеток также был реконструирован репертуар полной фракции и фракций CD4+- и CD8+-Т-лимфоцитов периферической крови пациента.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Пациент

Пациент: мужчина 28 лет с диагнозом «центральная форма анкилозирующего спондилита (болезнь Бехтерева)», HLA-B*27+-генотип. Диагноз был установлен за 7 лет до получения образцов периферической крови. Терапия: нестероидные противовоспалительные препараты (аркоксиа), метотрексат, ингибитор фактора некроза опухоли α (препарат «Хумира»). За 3 года до сбора образцов крови была проведена высокодозная иммуносупрессивная терапия (циклофосфан 200 мкг/кг + антитимоцитарный иммуноглобулин) с поддержкой аутологичными гемопоэтическими клетками (без обогащения по клеткам CD34+-субпопуляции). Через полгода после иммуносуппрессивной терапии было зафиксировано первое обострение заболевания на фоне перенесенной ОРВИ. На момент получения образцов крови пациент также находился в состоянии обострения, проявлявшегося в выраженных болевых ощущениях и сниженной подвижности пораженных суставов.

Выделение лимфоцитарной фракции клеток и отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов

Периферическую кровь в объеме 8 мл собирали в вакуумные пробирки с К3-ЭДТА (Vacutainer, BD Biosciences, США). Мононуклеарную фракцию выделяли стандартным методом центрифугирования в градиенте плотности фиколла (1,077 г/см3, «ПанЭко», Россия). В один момент времени (временная точка 1) были получены два образца периферической крови одинакового объема для реконструкции полного репертуара Т-лимфоцитов в двух независимых повторностях (образцы F1 и F2).  Из отдельных образцов периферической крови были выделены фракции CD4+- и СD8+-клеток с помощью набора реактивов Dynabeads (Invitrogen, США) для позитивной иммуномагнитной селекции.

Для реконструкции клонального репертуара с помощью проточной цитофлуорометрии (FACSVantage, BD Biosciences) из мононуклеарной фракции клеток крови были получены образцы клеток субпопуляции активированных Т-лимфоцитов периферической крови, определенной на основе экспрессии поверхностных маркеров дифференцировки CD38 и HLA-DR. В точке 1 была выделена субпопуляция лимфоцитов CD3+CD38+HLA-DR+. Через два месяца (временная точка 2) из периферической крови пациента были получены образцы клеток субпопуляций CD3+CD8+CD38+HLA-DR+ и CD3+CD8CD38+HLA-DR+. Для цитофлуорометрии использовались антитела CD3-APC (Invitrogen), CD8-FITC (Invitrogen), HLA-DR-PerCP (Invitrogen) и CD38-PE (IQProducts, Нидерланды) к поверхностным маркерам клеток человека. Окрашивание клеток антителами производили в соответствии с протоколами производителей. Клетки были собраны в 350 мкл буфера RLT (Qiagen, Нидерланды), после чего выделяли фракцию суммарной РНК.

Подготовка библиотек кДНК и секвенирование

Выделение РНК фракции мононуклеарных клеток периферической крови, а также фракций CD4+- и CD8+-клеток периферической крови проводили с использованием реагента TRIzol (Invitrogen) по инструкции производителя. Выделение РНК фракций Т-лимфоцитов, полученных методом проточной цитофлуорометрии, проводили с использованием набора реактивов RNAeasy Mini (Qiagen) по протоколу производителя. Подготовку библиотек кДНК бета-цепи ТКР проводили по ранее описанному протоколу [10]. кДНК библиотеки секвенировали на платформе HiSeq 2000/2500 (Illumina, США) в режиме парного чтения с длиной прочтения 100 нт.

Обработка результатов секвенирования

Предварительная обработка результатов секвенирования включала коррекцию ошибок секвенирования и подсчет числа уникальных молекул кДНК ТКР в библиотеке с помощью программного обеспечения MiGEC (на основе принципа молекулярного баркодирования) [8, 11]. Для определения V-, D- и J-сегментов, последовательности CDR3, подсчета численности клонотипов и формирования списка идентифицированных клонотипов для каждого образца использовали программное обеспечение MiXCR [12]. При восстановлении клонального репертуара образца использовали последовательности кДНК ТКР, прочитанные минимум дважды по результатам анализа последовательностей уникальных молекулярных меток (unique molecular identifier, UMI), что позволило устранить большую часть ошибочных последовательностей и существенно снизить искусственное разнообразие клонального репертуара [13]. Дальнейшую биоинформатическую обработку результатов проводили с помощью языка программирования R [14].

Ассоциацию обнаруженных клонотипов с тем или иным фенотипом Т-лимфоцитов осуществляли по совпадению нуклеотидной последовательности участка CDR3 и V-сегмента ТКР между репертуарами выделенных фракций Т-клеток.

Использованные опубликованные массивы секвенирования кДНК бета-цепей ТКР

В работе были использованы опубликованные данные, полученные при секвенировании репертуаров кДНК бета-цепей ТКР периферической крови и синовиальной жидкости HLA-B*27+-больных анкилозирующим спондилитом (данные доступны в публичной базе данных NCBI SRA по идентификатору SRP111372) [4]. Все использованные в работе опубликованные данные секвенирования были обработаны так же, как данные секвенирования, полученные для настоящей работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика исследованных образцов клеток и технологии реконструкции клонального репертуара

Для анализа клонального репертуара из периферической крови пациента с клинически установленным диагнозом «анкилозирующий спондилит» с помощью проточного цитофлуориметра были выделены 50 000 клеток, экспрессировавших маркеры CD3, CD38 и HLA-DR. На момент получения образцов крови состояние пациента характеризовалось выраженной болезненностью и ограниченной подвижностью пораженных суставов; антицитокиновая терапия не проводилась. По результатам цитофлуорометрии 2,6 % Т-лимфоцитов имели фенотип CD3+HLA-DR+, 1,5 % — CD3+CD38+HLA-DR+. Приведенные значения соответствовали опубликованным данным для периферической крови здоровых доноров того же возраста [15]. Повышенная представленность была отмечена для субпопуляции CD3+CD38+-Т-лимфоцитов: 39,2 % у пациента в сравнении с 5,8–24,6 % у здоровых доноров того же возраста.

В тот же момент времени из периферической крови донора были выделены клетки субпопуляций цитотоксических (CD4+) и хелперных (CD8+) Т-лимфоцитов, а также два образца клеток мононуклеарной фракции крови без дополнительного фракционирования (F1 и F2).

Для реконструкции клональных репертуаров бета-цепей Т-клеточного рецептора (ТКР) собранных образцов клеток мы применили оригинальную технологию, которая включала:

  1. применение эффекта «смены матрицы» при синтезе кДНК, что позволяет использовать универсальные праймеры и исключить неравномерную амплификацию последовательностей ТКР, возникающую из-за различий в структуре входящего в состав зрелого гена ТКР вариабельного сегмента (V-сегмента);
  2. применение технологии молекулярного баркодирования [8], что позволяет количественно оценить глубину анализа репертуара Т-лимфоцитов и представленность каждого клона Т-лимфоцитов в исследуемом образце [9], а также, в ходе предварительной обработки результатов секвенирования, скорректировать ошибки чтения и существенно снизить искусственное разнообразие клонального репертуара, возникающее в результате таких ошибок [11];
  3. введение образец-специфических последовательностей (баркодов) на оба конца молекул кДНК библиотеки, одна из которых вводится на этапе синтеза кДНК [10], что позволяет практически полностью исключить кросс-контаминацию образцов как в процессе пробоподготовки, так и в процессе секвенирования. Низкая вероятность кросс-контаминации в свою очередь позволяет ассоциировать выявляемые клонотипы с определенным фенотипом Т-лимфоцитов, основываясь на идентификации уникальной нуклеотидной последовательности вариабельной части ТКР в образцах различных фракций Т-клеток (CD4+, CD8+, F1 и F2, CD3+CD38+HLA-DR+).

После подготовки и секвенирования соответствующих библиотек кДНК бета-цепей ТКР для собранных образцов клеток было получено 20,25 млн прочтений: 6,23 и 7,53 млн для образцов F1 и F2 соответственно, 2,78 млн — для CD4+, 2,96 млн — для CD8+ и 0,75 млн — для CD3+CD38+HLA-DR+-фракций Т-лимфоцитов. При дальнейшей обработке и реконструкции последовательностей вариабельной части бета-цепей ТКР (определении нуклеотидной последовательности CDR3 и V-сегмента — идентификации Т-клеточного клонотипа) использовали последовательности кДНК, прочитанные не менее двух раз, что позволяло дополнительно снизить искусственное разнообразие репертуара, возникающее из-за идентифицируемых в образце ошибочных клонотипов [13, 16].

Общая глубина анализа клонального репертуара Т-лимфоцитов периферической крови пациента составила около 1,6 млн уникальных клонотипов. Для образцов F1, F2, CD4 и CD8 было проанализировано 3,3 млн отдельных молекул кДНК бета-цепей ТКР (969 000, 1 260 000, 601 000 и 652 000 соответственно). В соответствии с ранее опубликованной оценкой эффективности использованной технологии реконструкции репертуара общая глубина анализа составила около 3,3 млн Т-клеток [13, 16]. Массив результатов секвенирования для фракции CD3+CD38+HLA-DR+ содержал 17 296 последовательностей кДНК бета-цепей ТКР, прочитанных минимум дважды, тогда как количество клеток фракции составило 50 000. Таким образом, в среднем, каждая последовательность кДНК ТКР, попавшая в анализ, представляла мРНК ТКР отдельного Т-лимфоцита, и общая глубина анализа фракции активированных Т-лимфоцитов составила около 17 000 Т-клеток.

Анализ представленности клонотипов фракции активированных Т-лимфоцитов в общем репертуаре Т-клеток

На первом этапе анализа клонального репертуара фракции активированных Т-лимфоцитов мы исследовали распределение обнаруженных клонотипов в общем репертуаре Т-клеток периферической крови пациента. Более 85 % (10 212 из 11 927) клонотипов фракции активированных Т-клеток не были обнаружены ни в одном из репертуаров не фракционированных Т-клеток (F1 и F2) или фракций цитотоксических или хелперных Т-лимфоцитов (табл. 1). Вероятность обнаружения клонотипа в образце пропорциональна численности клона Т-лимфоцитов с таким ТКР в общем пуле Т-клеток периферической крови (т. е. представленности клонотипа в репертуаре). Высокое разнообразие и различная представленность клонов репертуара Т-клеток при сравнительно небольшом объеме исследуемого образца может объяснять значительную долю несовпадающих клонотипов между независимыми образцами Т-клеток, полученными в один момент времени.

Современная оценка теоретического разнообразия репертуара бета-цепей ТКР составляет порядка 108 вариантов [17], а диапазон представленности клонотипов в образцах полного репертуара, исследованных в нашей работе, составляет 1,5 % — 8,6 x 10–6 % Т-клеток периферической крови. Чтобы определить, являлась ли наблюдаемая степень соответствия полному репертуару характерной именно для репертуара фракции CD3+CD38+HLA-DR+, мы проанализировали степень совпадения клонального состава образцов полного репертуара (F1) и отдельных фракций Т-клеток, выделенных на основе экспрессии других поверхностных маркеров (CD4 и CD8), с образцом F2. При этом, для соответствия глубине анализа фракции активированных Т-лимфоцитов, репертуары образцов F1, CD4 и CD8 были восстановлены на основе соответствующего числа случайно отобранных in silico молекул кДНК ТКР (репертуары *F1, *CD4 и *CD8). После 100 независимых раундов такого анализа около 30 % клонотипов для каждого репертуара совпадали с клонотипами в образце F2 и представляли при этом 30–50 % от общего числа Т-клеток репертуаров *F1, *CD4 и *CD8. Соответствующие показатели для репертуара фракции CD3+CD38+HLA-DR+-клеток оказались в два раза ниже (рис. 1). Это свидетельствует о существенном обогащении фракции CD3+CD38+HLA-DR+-Т-лимфоцитов клонами Т-клеток, представленность которых в полном репертуаре недостаточна для обнаружения в идентичном по объему независимом образце Т-клеток.

Чуть более 1 500 клонотипов репертуара фракции активированных Т-лимфоцитов (13,1 % от клонального разнообразия и около 20 % от числа проанализированных Т-клеток фракции) были обнаружены хотя бы в одном из двух независимых образцов не фракционированных Т-лимфоцитов периферической крови (F1 и F2) при достигнутой глубине анализа полного репертуара в 2 млн Т-клеток. Суммарно доля Т-клеток периферической крови, представленных такими клонотипами, составила 8,5 %. При этом лишь часть из них составляли клонотипы с относительно высокой представленностью в общем репертуаре Т-лимфоцитов пациента (рис. 2). Так, из 100 наиболее высокопредставленных в общем репертуаре клонотипов только 45 были обнаружены в репертуаре CD3+CD38+HLA-DR+-Т-лимфоцитов (39 и 6 клонотипов фракций цитотоксических и хелперных Т-лимфоцитов соответственно).

Анализ степени совпадения клонального состава исследованных образцов показал, что основная часть фракции CD3+CD38+HLA-DR+-Т-лимфоцитов как по клональному разнообразию, так и по числу Т-клеток фракции была представлена клонами, имевшими низкую численность в общем пуле Т-лимфоцитов пациента. Низкая численность около 90 % клонотипов фракции обуславливает невозможность обнаружения таких клонотипов в образцах не фракционированных периферических Т-клеток при обычной глубине анализа в несколько миллионов отдельных Т-клеток периферической крови.

Структура клонального состава фракции CD3+CD38+HLA-DR+-Т-лимфоцитов

Полная структура вариабельного домена бета-цепи ТКР целиком или в значительной степени определяет специфичность клона Т-лимфоцитов в отношении распознаваемого антигена в контексте определенной молекулы главного комплекса гистосовместимости (main histocompatibility complex, МНС) [18, 19, 20]. При анализе клонального репертуара фракции активированных Т-лимфоцитов каждый клонотип был представлен как комбинация аминокислотной последовательности гипервариабельного участка CDR3 и идентификатора V-сегмента, входящего в состав зрелого гена ТКР и определяющего структуру остальной части вариабельного домена бета-цепи.

Клональный репертуар фракции активированных Т-лимфоцитов пациента характеризовался высоким относительным разнообразием, сопоставимым с разнообразием полного репертуара. В соответствии с результатами секвенирования практически каждая Т-клетка фракции, попавшая в анализ, представляла уникальный вариант вариабельного домена бета-цепи ТКР: из 17 000 отдельных молекул кДНК ТКР было восстановлено порядка 12 000 отдельных клонотипов. Для сравнения: в каждом из образцов тотальной фракции Т-лимфоцитов (F1 и F2) из 1 млн последовательностей отдельных молекул кДНК ТКР было идентифицировано около 550 000 отдельных клонотипов.

Распределение представленности клонотипов фракции CD3+CD38+HLA-DR+ также совпадало с распределением полного репертуара Т-клеток (образец F1). Наиболее высокопредставленный клонотип фракции занимал 0,27 % от общего числа Т-лимфоцитов. Для сравнения: наиболее высокопредставленный клонотип полного репертуара (F1) представлял 1,6 % Т-клеток репертуара. На 100 наиболее высокопредставленных клонотипов образцов CD3+CD38+HLA-DR+ и F1 пришлось 5,6 и 9 % Т-клеток репертуара соответственно. Также не было обнаружено существенных различий между образцами F1 и CD3+CD38+HLA-DR+ в распределении представленности групп клонотипов, в состав бета-цепи ТКР которых входит определенный V-сегмент и которые, таким образом, представляют собой клонотипы, предположительно распознающие пептиды в комплексе со сходными молекулами MHC. Полученные результаты демонстрируют отсутствие во фракции активированных Т-клеток периферической крови пациента значительного по сравнению с полным репертуаром обогащения клонотипами с определенной структурой вариабельного домена бета-цепи ТКР.

Поиск клонотипов, ассоциированных с развитием анкилозирующего спондилита

Непосредственное участие в иммунном ответе клеток, экспрессирующих маркеры Т-клеточной активации, позволяет предполагать обогащение репертуара активированной фракции клонотипами, которые связаны с развитием воспаления в период обострения АС. Для характеристики репертуара Т-клеток фракции CD3+CD38+HLA-DR+ мы провели поиск ассоциированных с АС клонотипов, обнаруженных ранее в периферической крови и синовиальной жидкости HLA-B*27-положительных пациентов [3, 4]. В массив для поиска были также добавлены клонотипы, обнаруженные в синовиальной жидкости (СЖ) минимум двух из трех HLA-B*27-позитивных пациентов, репертуары которых были исследованы нами ранее [4]. Такое ограничение было принято для снижения эффекта случайного совпадения нерелевантных клонотипов между двумя донорами и, таким образом, поиска клонотипов, специфически присутствующих в месте воспаления у разных доноров. Массив для поиска включал 1 913 клонотипов: 11 последовательностей CDR3, составляющих мотив, ассоциированный с АС по результатам двух упомянутых работ, а также 1 902 клонотипа, найденных в синовиальной жидкости больных АС.

Среди 11 927 клонотипов репертуара фракции активированных Т-лимфоцитов мы обнаружили 32 полных совпадения аминокислотной последовательности вариабельного домена бета-цепи ТКР c клонотипами из списка. Большинство совпавших между массивами клонотипов являлись сравнительно низкопредставленными во фракции CD3+CD38+HLA-DR+ Т-клеток (рис. 3).

Восемь из этих 32 клонотипов не были обнаружены в репертуарах Т-клеток периферической крови HLA-B*27-позитивных здоровых доноров (данные из [4]) (табл. 2), что предполагает отсутствие экспансий таких клонотипов у здоровых доноров [4, 21, 22]. Один из этих 8 клонотипов, TRBV9_CASSVGVYSTDTQYF_TRBJ2-3, входит в состав 11 вариантов последовательностей вариабельной части ТКР, составляющих ассоциированный с АС мотив CDR3 бета-цепи ТКР, обнаруженный ранее также в синовиальной жидкости у HLA-B*27-позитивных пациентов с реактивным артритом [5, 23]. Как и во всех трех ранее опубликованных случаях обнаружения данного клонотипа в образцах пациентов со спондилоартропатиями (АС, реактивный артрит (РеА)), в настоящей работе данный клонотип также был ассоциирован с субпопуляцией CD8+ Т-лимфоцитов.

Через 2 месяца, на протяжении которых состояние пациента не изменилось, мы провели повторный анализ клонального репертуара Т-лимфоцитов активированной фракции (временная точка 2). С помощью проточной цитофлуорометрии были собраны 16 000 и 10 500 клеток фракций CD3+CD8+CD38+HLA-DR+ и CD3+CD8CD38+HLA-DR+ периферической крови, для которых было восстановлено 3 900 и 8 300 клонотипов бета-цепей ТКР соответственно. При сходной по числу выявленных клонотипов глубине анализа репертуара фракции активированных Т-клеток между двумя временными точками совпало около 3 % клонотипов, представлявших Т-лимфоциты цитотоксической и хелперной субпопуляций в равной пропорции: из 323 клонотипов, попавших в репертуар активированных Т-клеток в обеих временных точках, 154 были ассоциированы с фенотипом CD8+, 136 — с CD4+ и для 33 фенотип не был определен.

В составе репертуара фракций CD8+ активированных Т-лимфоцитов во второй временной точке вновь был обнаружен клонотип TRBV9_CASSVGVYSTDTQYF_TRBJ2-3, а также еще 3 клонотипа, обнаруженные ранее в синовиальной жидкости больных АС и не найденные в образцах периферической крови здоровых HLA-B*27-позитивных доноров (табл. 2). Аминокислотная последовательность вариабельного домена бета-цепи ТКР еще одного из обнаруженных в точке 2 клонотипов имела сравнительно высокую степень гомологии с опубликованными АС-ассоциированными клонотипами за счет идентичного V-сегмента в составе гена ТКР и сходной последовательности гипервариабельного участка CDR3. Данный клонотип был обнаружен в репертуаре периферической крови 40 % больных АС (n = 25) [4] и двух из трех исследованных репертуаров Т-клеток синовиальной жидкости, но не был обнаружен ни в одном из образцов крови HLA-B*27-позитивных здоровых доноров (n = 7) (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Поверхностные маркеры CD38 и HLA-DR позволяют выделить субпопуляцию Т-клеток, определяемых как активированные Т-лимфоциты и осуществляющих эффекторные функции при реализации иммунного ответа, например в ходе противовирусного ответа [24, 25, 26, 27]. Повышенное число CD38+HLA-DR+-Т-клеток в периферической крови показано у пациентов с аутоиммунными воспалительными заболеваниями кишечника, которые часто регистрируют при различных спондилоартропатиях, включая анкилозирующий спондилит [28]. В недавнем исследовании эффекта антицитокиновой терапии было показано повышенное содержание цитотоксических HLA-DR+-Т-клеток в периферической крови больных АС по сравнению со здоровыми донорами, а также значимые различия по количеству HLA-DR+ хелперных Т-клеток между пациентами, для которых терапия оказалась эффективной и неэффективной [29]. Обнаружение группы клонов Т-клеток с высокогомологичной структурой ТКР, ассоциированных с АС [3, 4], определяет необходимость изучения клонального состава функционально различных субпопуляций Т-клеток при АС для выявления роли Т-лимфоцитов в развитии заболевания. В данной работе, используя одну из самых современных технологий подготовки библиотек кДНК и анализа данных секвенирования, мы впервые исследовали структуру и клональный состав репертуара субпопуляции активированных Т-лимфоцитов периферической крови при АС. Важными для данного исследования особенностями метода являются низкая вероятность искажений клонального состава и возможность количественной оценки представленности каждого выявленного клонотипа в образце.

Анализ представленности клонотипов фракции активированных Т-клеток в полным репертуаре Т-лимфоцитов периферической крови показал уникальность клонального состава фракции: субпопуляция активированных Т-лимфоцитов обогащена клонотипами, не попадающими в анализ при исследовании не фракционированных образцов или отдельных субпопуляций CD8+- и CD4+-Т-клеток периферической крови вследствие низкой численности клеток таких клонотипов. Значительная степень несовпадения клонального репертуара Т-клеток активированной фракции при сравнительном анализе образцов в двух временных точках, по-видимому, также является следствием малой представленности клонотипов фракции.

Низкая численность большинства клонотипов активированной фракции Т-клеток может быть связана с обогащением клетками, участвующими в воспалительной реакции и локализующимися, в большей степени, в очагах воспаления. Повышенная численность клеток АС-ассоциированных клонов в синовиальной жидкости по сравнению с периферической кровью при остром синовите у больных АС показана в недавней работе Komech и соавт. [4]. Вместе с тем при достигнутой глубине анализа разнообразие клонального состава фракции практически совпадает с разнообразием полного репертуара Т-лимфоцитов периферической крови. Исследуя репертуар фракции, мы также не обнаружили выраженных клональных экспансий или обогащения клонотипами с определенной структурой вариабельного домена бета-цепи ТКР по сравнению с полным репертуаром. С использованием недавно созданной базы данных клонотипов с охарактеризованной специфичностью к различным комплексам МНС–пептид [30] среди клонотипов активированной фракции было обнаружено несколько совпадений аминокислотной последовательности бета-цепи TКР с клонотипами, специфичными к иммуногенным пептидам вирусов гриппа, CMV и EBV. Можно заключить, что обнаруженные в периферической крови пациента с АС Т-лимфоциты, экспрессирующие маркеры активации HLA-DR и CD38, представляют фракцию активно участвующих в иммунном ответе Т-клеток, специфичных к широкому кругу антигенов.

Для поиска клонотипов, связанных с АС, мы использовали данные о составе клонального репертуара Т-клеток периферической крови и синовиальной жидкости больных АС и периферической крови здоровых HLA-B*27-позитивных доноров, полученные ранее с использованием той же технологии реконструкции Т-клеточного репертуара. После анализа репертуаров двух полученных в разное время и с помощью разных стратегий цитофлуориметрии образцов Т-клеток, экспрессирующих маркеры активации, нами были найдены 11 клонотипов, не обнаруженные ни в одном из репертуаров здоровых доноров и при этом идентифицированные в синовиальной жидкости минимум двух больных АС. Девять из них были обнаружены также и в репертуарах периферической крови больных. Идентификация данных клонотипов в репертуарах HLA-B*27+-пациентов с АС и отсутствие их у здоровых HLA-B*27+-доноров демонстрирует способность прохождения такими клонотипами селекции в тимусе при наличии HLA-B*27, с последующей клональной экспансией у пациентов, и отсутствие соответствующих клональных экспансий у здоровых HLA-B*27+-индивидов [21].

Среди указанных 11 последовательностей вариабельного домена бета-цепи ТКР был обнаружен клонотип TRBV9_CASSVGVYSTDTQYF_TRBJ2-3, ассоциированный с АС по результатам недавних работ по анализу клонального репертуара Т-клеток периферической крови [3] и синовиальной жидкости [4] больных АС. Ранее идентичный клонотип бета-цепи ТКР был обнаружен в синовиальной жидкости HLA-B*27+-пациентов с реактивным артритом [5, 23]. Как и в настоящей работе, во всех процитированных исследованиях данный клонотип ассоциирован с субпопуляцией цитотоксических Т-лимфоцитов. Проанализировав клональный репертуар двух независимых образцов фракции активированных Т-лимфоцитов периферической крови, полученных с разницей в 2 месяца с использованием разных стратегий выделения клеточных субпопуляций, нам удалось показать длительное присутствие Т-клеток данного клонотипа в активированном состоянии в периферической крови пациента.

Также в составе фракции цитотоксических активированных Т-лимфоцитов нами был обнаружен клонотип TRBV9_CASSVGGDYGYTF_TRBJ1-2, найденный в образцах периферической крови 40 % больных (n = 25) и двух образцах синовиальной жидкости пациентов (n = 3). Высокая частота обнаружения в крови и синовиальной жидкости больных АС, определенная степень гомологии структуры вариабельного домена бета-цепи ТКР данного клонотипа с другими, ранее обнаруженными у больных РеА и АС клонотипами, и отсутствие в образцах периферической крови здоровых HLA-B*27+-доноров позволяют предположить возможную связь данного клонотипа с воспалительными процессами при анкилозирующем спондилите. Кроме того, по-видимому, некоторые клонотипы фракции хелперных Т-клеток, также могут быть связаны с АС, о чем говорит обнаружение в репертуаре активированных Т-клеток нескольких CD4+-клонотипов с совпадающей структурой вариабельного домена бета-цепи ТКР с клонотипами CD4+-фракций Т-клеток синовиальной жидкости больных АС и не обнаруженных в периферической крови здоровых HLA-B*27+-доноров.

ВЫВОДЫ

В нашем исследовании впервые изучен клональный состав фракции Т-лимфоцитов, экспрессирующих маркеры активации HLA-DR и CD38, периферической крови пациента с анкилозирующим спондилитом. Показано обогащение фракции малочисленными в общем репертуаре Т-клеток клонотипами и отсутствие выраженной олигоклональности субпопуляции на фоне активной стадии заболевания. В составе репертуара фракции обнаружен ряд клонотипов субпопуляций цитотоксических и хелперных Т-клеток, вероятно, связанных с воспалительной реакцией при АС. Наиболее значительным результатом, по мнению авторов, является обнаружение в субпопуляции активированных цитотоксических Т-лимфоцитов крови клонотипа, ассоциированного с АС по результатам более ранних исследований. Экспрессия маркеров активации клетками ассоциированных с АС клонотипов демонстрирует активное участие таких клонов Т-клеток в воспалительной реакции. Дальнейшие исследования, направленные на изучение клонального состава функционально различных субпопуляций Т-клеток и определение антигенной специфичности выявленных клонотипов, позволят глубже понять механизмы возникновения и развития АС и разработать способы специфической терапии данного заболевания.

КОММЕНТАРИИ (0)