Развитие и прогрессирование неалкогольной жировой болезни печени (НАЖБП), одной из форм которой является неалкогольный стеатогепатит (НАСГ), сопровождается повышением в плазме крови и печени провоспалительных цитокинов, в частности фактора некроза опухоли альфа (TNFα) [1, 2]. Повышенный уровень TNFα способствует воспалению печени, отложению в ней липидов и их перекисному окислению, активации клеток Купфера и апоптозу гепатоцитов, формированию инсулинорезистентности [3]. Снижение концентрации TNFα в плазме крови приводит к улучшению показателей функционального состояния печени [4, 5].

Белки семейства TNF проявляют свои биологические эффекты посредством взаимодействия с рецепторами суперсемейства TNFR [6]. Рецепторы к TNFα (mbTNFR) представлены двумя типами трансмембранных белков (mbTNFRI, mbTNFRII), отличающимися друг от друга наличием или отсутствием во внутриклеточной области домена смерти, активация которого приводит к запуску сигнальных путей апоптоза или некроптоза [7]. Помимо мембраносвязанных, существуют и растворимые рецепторы TNFα (sTNFR), образующиеся в результате отщепления внекле­точной части белка от mbTNFR с помощью металлопротеиназ семейства ADAM [8]. sTNFR связываются с TNFα и выступают как антагонисты mbTNFR, препятствуя запуску TNFα-сигнальных путей. В небольшой концентрации растворимые рецепторы TNFα обнаружены в сыворотке и моче здоровых людей. Уровень циркулирующих TNFR увеличивается при хроническом вирусном гепатите [9], циррозе печени [10], НАЖБП [11, 12], что указывает на развитие воспалительного процесса в организме при этих заболеваниях и активацию Т-клеточного иммунного ответа, в частности активацию CD8+ T-клеток, экспрессирующих металлопротеиназу ADAM-17 [8]. Предполагается, что уровень и соотношение растворимых и мембраносвязанных рецепторов TNFα играет существенную роль не только в индукции процессов гибели гепатоцитов и повреждении печени, но и в процессах регенерации и поддержании гомеостаза этого органа [13, 14, 15, 16]. Вероятно, соотношение между растворимыми и мембраносвязанными формами TNFRI и TNFRII во многом определяет силу иммунного ответа и воспалительных реакций в организме. Оказывается, мутации в генах TNFRSF1A и TNFRSF1B влияют, соответственно, на содержание sTNFRI и sTNFRII в плазме крови и на количество mbTNFRI и mbTNFRII на поверхности клеток врожденного иммунитета [17]. В связи с этим можно предположить, что полиморфные варианты генов рецепторов TNFα могут вносить значительный вклад в этиологию и патогенез заболеваний печени, в частности НАСГ. В настоящее время предпринимаются попытки установить связь полиморфизма генов, кодирующих TNFR, с развитием НАЖБП. Однако такого рода данные еще малочисленны и касаются связи полиморфизма генов TNFRSF1A и TNFRSF1B с развитием биллиарного цирроза, алкогольной болезни печени и гепатоцеллюлярной карциномы [18, 19, 20]. Сведения об ассоциации полиморфных вариантов генов рецепторов TNFα с развитием НАЖБП практически отсутствуют в литературе. В связи с этим, целью исследования явилось изучение влияния полиморфных вариантов генов TNFRSF1A и TNFRSF1B на развитие НАСГ у жителей Карелии.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал для исследования получен при содействии кафедры пропедевтики внутренних болезней и гигиены Медицинского института ПетрГУ и клинико-диагностической лаборатории НУЗ ОКБ на ст. Петрозаводск ОАО «РЖД». В исследовании использовали 242 образца венозной кро­ви пациентов с НАСГ (110 мужчин и 132 женщин) и 151 образец крови здоровых доноров (64 мужчин и 87 жен­щин). Доноры, включенные в дальнейшем в контрольную группу (группу здоровых доноров), были также обследова­ны врачами НУЗ ОКБ на ст. Петрозаводск ОАО «РЖД» в ходе диспансеризации. Все испытуемые были разделены на клинические группы: контрольная группа — здоровые доноры, без клинических проявлений НАЖБП (возраст 48,04 ± 2,26 года); группа пациентов с диагнозом НАСГ (возраст 50,14 ± 2,46 года). Возраст представлен в виде среднего значения ± ошибка среднего. Возраст доноров двух групп исследования значимо не различался (U = 132,5; р = 0,637). Общими критериями включения пациентов в обе наблюдаемые группы, явились: лица обоих полов, давшие информированное согласие на проведение исследования, проживающие в Республике Карелия, с отсутствием вирусной этиологии хронического гепатита на основании отрицательных результатов исследования HBsAg вируса гепатита В и антител к вирусу гепатита С, а также с отсутствием алкогольной, лекарственной и аутоиммунной этиологии болезни печени на основании анамнестических, клинических, лабораторных данных. Критериями включения для больных НАСГ, кроме указанных, стали: впервые установленный диагноз НАЖБП слабой и умеренной активности до терапии (форма НАЖБП — НАСГ). Общими критериями исключения пациентов для обеих изучаемых групп явились: перенесенные в последний месяц инфекционно-воспалительные заболевания, беременность и лактация, курение, сахарный диабет, индекс массы тела ≥ 30 кг/м2, прием лекарственных, в том числе гепатотропных препаратов. Диагноз НАЖБП устанавливался на основании традиционных клинических, лабораторных, инструментальных и гистологических данных. Оценивались следующие лабораторные показатели крови: активность АлАТ и АсАТ, активность ЩФ (данные показатели определяли в автоматическом режиме на биохимическом анализаторе «RandomAccessF-15», «BioSystems», Испания). При ультразвуковом исследовании у всех больных выявлялось увеличение размеров печени и усиление эхогенности паренхимы органа. У части больных диагноз НАСГ подтвержден при гистологическом исследовании биоптатов печени.

Забор венозной крови для исследования в объеме 10 мл проводили до назначения лекарственных, в том числе гепатотропных, препаратов с использованием вакуумных пробирок с антикоагулянтом (ЭДТA). 250 мкл использовали для выделения ДНК. Часть венозной крови использовали для получения плазмы. Плазму крови объе­мом 200 мкл использовали для определения концентрации TNFα. Остальной объем крови был использован для определения биохимических показателей крови.

На проведение исследования получено согласие Комитета по медицинской этике Минздравсоцразвития РК и ПетрГУ (протокол № 39 от 15 ноября 2017 г).

У части доноров, выбранных случайным образом, определяли содержание TNFα в плазме крови иммуноферментным методом (ИФА) с использованием набора «Human TNFα Platinum ELISA» («eBioscience», Австрия). Исследовали 30 образцов плазмы крови здоровых доноров (возраст 49,11 ± 1,81 года) и 60 образцов плазмы крови больных НАСГ (возраст 49,95 ± 2,74 года) с равным количеством мужчин и женщин в группах. Возраст лиц в исследуемых группах достоверно не различался (U = 181,5; р = 0,535). Оптическую плотность раствора измеряли на микропланшетном фотометре Sunrise («Tecan», Австрия) при длине волны 450 нм и референсной длине волны 620 нм.

ДНК выделяли из периферической крови на микро­колонках с помощью набора «К-Сорб» (Синтол, Россия). Качество и количество ДНК определяли спектрофотометрически на приборе «SmartSpec» («Bio-Rad», США).

Для амплификации части гена TNFRSF1A, включающую позицию 339 (rs767455), использовали праймеры: прямой 5’agtggctgaggttaggac3’ и обратный 5’ctatgcccgagtctcaac3’, описанные в работе [21]. Для амплификации области гена TNFRSF1B, включающей позицию 587 (rs1061622), использовали праймеры: прямой 5’gcacacatcgtcactctc3’ и обратный 5’aaggagtgaatgaatgagac3’, описанные в работе [21]. Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в амплификаторе iCycler iQ5 («Bio-Rad», США), используя реакционную смесь («Евроген», Россия). ПЦР-продукты, содержащие rs767455, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции Bsе1 I (1 e.a.) («Сибэнзим», Россия) в течение 3 ч при 65 °С. ПЦР-продукты, содержащие rs1061622, обрабатывали эндонуклеазой рестрикции FatI (1 e.a.) («Сибэн­зим», Россия) в течение 1 ч при 55 °С. После рестрикции фрагменты ДНК разделяли в 1,5%-м агарозном геле, используя трис-ацетатный буфер.

Статистическую обработку данных проводили в программе Statgraphics 2.1. Достоверность различий частот аллелей и генотипов в группах оценивали с помощью критерия χ2, биохимических показателей между группами — с помощью непараметрического критерия U Уилкоксона– Манна–Уитни. Непараметрический критерий для анализа был использован в связи с несоответствием распределений показателей в группах нормальному. Для оценки влияния генотипов на биохимические показатели использовали дисперсионный анализ Краскела–Уоллиса. Для оценки риска развития НАСГ рассчитывали отношение шансов (ОШ) с 95%-м доверительным интервалом (95% ДИ) [22]. Различия считали достоверными при значении p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На рис. 1 и рис. 2 представлены электрофореграммы продуктов рестрикции ПЦР-фрагметов, содержащих rs767455 и rs1061622.

Проанализированы частоты аллелей и генотипов по полиморфному маркеру T>C rs767455 гена TNFRSF1A в контрольной группе и группе пациентов с НАСГ.

Проводили тест на соответствие распределения равновесию Харди–Вайнберга. В контрольной группе и группе НАСГ обнаружено отклонение частот аллелей и генотипов от уравнения Харди–Вайнберга (χ2 = 8,25 (df = 2, p < 0,05), χ2 = 21,64 (df = 2, p < 0,05) соответственно).

Как видно из табл. 1, частоты аллелей и генотипов по полиморфному маркеру T>C (rs767455) гена TNFRSF1A не различались в группах здоровых доноров и больных НАСГ.

Проанализированы частоты аллелей и генотипов по 587T>G полиморфному маркеру гена TNFRSF1B в контрольной группе и группе пациентов с НАСГ.

В исследованных группах не обнаружено отклонения частот аллелей и генотипов от уравнения Харди–Вайнбер­га (χ2 = 0,30 (df = 2, p > 0,05), χ2 = 4,16 (df = 2, p > 0,05) соответственно в группе здоровых доноров и группе больных НАСГ).

Как видно из табл. 2, распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера 587T>G гена TNFRSF1B различается в группах здоровых и больных НАСГ людей. Встречаемость аллеля G в группе лиц с диагнозом НАСГ значительно выше, чем в контрольной группе. У носителей аллеля G повышен риск развития данного заболевания (ОШ = 4,83 (95% ДИ: 2,72–8,57)).

Оценивали влияние rs1061622 гена TNFRSF1B на некоторые функциональные биохимические показатели состояния печени и содержание TNFα в плазме крови (табл. 3). Достоверные различия изучаемых показателей у носителей разных генотипов в двух сравниваемых группах не обнаружены. Не обнаружено влияние генотипа по указанному маркеру на биохимические показатели крови как в группе здоровых доноров, так и в группе пациентов с НАСГ (р > 0,05).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Мы проанализировали связь полиморфных вариантов rs767455 гена TNFRSF1A и rs1061622 гена TNFRSF1B с развитием НАСГ. Указанные полиморфные варианты по данным литературы ассоциированы с рядом воспалительных заболеваний и изменением уровня TNFα в плазме крови [23]. Полиморфный вариант rs767455 представляет собой синонимическую мутацию, расположенную в позиции 36 первого экзона гена TNFRSF1A. Известно, что синонимические мутации могут влиять на правильность и эффективность сплайсинга мРНК, изменять ее структуру и влиять на фолдинг белков [24]. Показано, что замена аденина на гуанин в 36-й позиции гена TNFRSF1A приводит к изменению кодона ССА на CCG, что влияет на эффективность трансляции [25]. Кроме того, данная мутация в сочетании с другими мутациями (гаплотип T-A-T по rs4149570-rs767455-rs1800692) в гене TNFRSF1A способствует снижению пула мРНК без экзона 2 [26]. Нами не обнаружена ассоциация данного полиморфного маркера гена TNFRSF1A с развитием НАСГ среди обследованных лиц. Однако нами выявлена связь носительства аллеля G по T>G rs1061622 полиморфному маркеру гена TNFRSF1B с повышением риска развития НАСГ.

Полиморфный вариант rs1061622 гена TNFRSF1B представляет собой замену тимина на гуанин в позиции 587 экзона 6, которая приводит к замене аминокислотных остатков (метионин заменяется на аргинин) в позиции 196 трансмембранного домена белка, близко к сайту протеолитического расщепления металлопротеазами семейства ADAM. Указанная мутация влияет на процесс отщепления внеклеточного фрагмента трансмембранного белка и его выходу во внеклеточное пространство (эктодоменный шеддинг). Некоторые исследования показали, что у носителей генотипа ТТ (Met196) уровень sTNFRII ниже чем у лиц, имеющих Arg196-форму рецептора [27]. По данным других авторов, у носителей ТТ+TG генотипов по данному полиморфному маркеру уровень sTNFRII в плазме крови выше, чем у доноров с генотипом GG [28].

Таким образом, указанная мутация может способствовать изменению соотношения мембраносвязанных и растворимых TNFRII как в обычных физиологических условиях, так и при воспалении. Как уже отмечалось, у больных с различными заболеваниями печени наблюдается повышение содержания sTNFRI и sTNFRII в плазме крови и печени. Причем уровень этих белков может позитивно коррелировать с тяжестью заболевания [10, 12, 29, 30]. Однако физиологическая роль усиления эктодоменного шеддинга рецепторов TNFα при воспалении не совсем понятна. Так, увеличение содержания sTNFRII и связанное с ним уменьшение количества mbTNFRII на поверхности клеток могут привести к активации сигнальных путей, опосредованных mbTNFRI и направленных на индукцию апотоза [7]. Помимо этого, растворимые формы TNFR могут функционировать в качестве физиологических аттенюаторов активности TNFα, конкурируя за лиганд с мембраносвязанными рецепторами. С другой стороны, растворимые рецепторы, вероятно, способны стабилизировать и сохранять циркулирующий растворимый TNFα и, таким образом, действовать как его агонисты [31].

Формы Met196 и Arg196 TNFRII различаются по своей способности опосредовать сигналинг TNF и активировать апоптоз или некроптоз. Так, в эпителиальных клетках линии HeLaS3, трансфицированных плазмидой pcDNA3.1, содержащей аллель Arg196 гена TNFRII, наблюдали снижение активности ядерного фактора κB и рекрутирования TRAF2 после стимуляции клеток рекомбинантным TNFα [32]. Последующая активация сигнального пути TNFRI в этих клетках приводила к индукции апоптоза, тогда как в клетках, трансфицированных плазмидой с аллелем дикого типа Met196, выживаемость клеток была на более высоком уровне. Необходимо отметить, что НАСГ сопровождается активацией гибели гепатоцитов [33]. Можно предположить, что полиморфный вариант rs1061622 гена TNFRSF1B вносит свой вклад в формирование и прогрессирование НАСГ через индукцию сигнальных путей, определяющих гибель клеток печени.

Другой механизм вовлечения полиморфного варианта rs1061622 гена TNFRSF1B в этиологию и патогенез НАСГ может быть связан с его влиянием на уровень провоспалительных цитокинов [34]. Мы исследовали содержание TNFα в плазме крови носителей разных аллелей и генотипов по указанному полиморфному маркеру в группах здоровых и больных НАСГ людей. Однако достоверных различий в уровне этого цитокина в группах сравнения мы не выявили. Несмотря на это, мы не будем строго утверждать об отсутствии влияния полиморфного варианта rs1061622 гена TNFRSF1B на содержание TNFα, поскольку полученные результаты могут быть следствием как статистических флуктуаций из-за малочисленности выборки, по крайней мере, в группе здоровых доноров, так и влияния других факторов на этот показатель. Эти обстоятельства требуют дальнейшего изучения механизмов вовлечения указанного полиморфного маркера в этиологию и патогенез НАСГ.

ВЫВОДЫ

Не обнаружена связь носительства полиморфного варианта T>C rs767455 гена TNFRSF1A с развитием НАСГ у жителей Карелии. Выявлена ассоциация полиморфного варианта T>G rs1061622 гена TNFRSF1B с развитием НАСГ. Указанный полиморфный маркер может быть вовлечен в генетическую предрасположенность жителей Карелии к НАСГ.