ОБЗОР

Длинные некодирующие РНК — перспективная мишень для терапии различных заболеваний

Информация об авторах

1 Лаборатория функциональной геномики,
Медико-генетический научный центр, Москва

2 Лаборатории медицинских генетических технологий, отдел фундаментальных исследований НИМСИ,
Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова, Москва

3 Лаборатория функционального анализа генома,
Московский физико-технический институт (государственный университет), Долгопрудный

Для корреспонденции: Филатова Александра Юрьевна
ул. Москворечье, д. 1, г. Москва, 115478; ur.xednay@ccaam

Информация о статье

Вклад авторов в работу: А. Ю. Филатова — план статьи, анализ литературы, подготовка черновика рукописи; П. А. Спарбер — анализ литературы, подготовка черновика рукописи; И. А. Кривошеева — анализ литературы, подготовка черновика рукописи; М. Ю. Скоблов — подготовка черновика рукописи. Все авторы принимали участие во внесении исправлений в текст рукописи.

Статья получена: 25.06.2017 Статья принята к печати: 28.06.2017 Опубликовано online: 18.07.2017
|

За последнее десятилетие было проведено множество исследований с применением методов секвенирования нового поколения (next generation sequensing), позволивших выявить удивительный феномен: примерно 70 % генома человека транскрибируется, но только 1,5 % транскриптов кодируют белки. Всё остальное приходится на некодирующие РНК (нкРНК). Они включают хорошо изученные классы рибонуклеиновых кислот: рибосомные (рРНК), транспортные (тРНК), микро-, малые ядерные (мяРНК) и малые ядрышковые РНК (мякРНК) и др. В последние годы активно исследуется еще один класс нкРНК — длинные некодирующие РНК (днРНК). Ими называют транскрипты длиной более 200 нуклеотидов, которые не содержат протяженной открытой рамки считывания.

По последним данным проекта GENCODE (Encyclopedia of genes and gene variants), в геноме человека насчитывается 15 787 генов длинных некодирующих РНК [1]. При этом функциональная значимость описана менее чем для 200 из них [2]. Но уже ясно, что днРНК — это гетерогенная группа транскриптов, выполняющих разнообразные функции в клетке. Они могут влиять на экспрессию генов на транскрипционном уровне за счет образования комплексов с транскрипционными факторами [34] или привлечения хроматин-модифицирующих комплексов, таких как репрессионные комплексы PRC1 [5], PRC2 [467], LSD1 [8] или активирующий комплекс TrxG [9]. Кроме того, днРНК могут оказывать влияние и на посттранскрипционном уровне. Они способны активно взаимодействовать с микроРНК, тем самым регулируя уровень экспрессии их мишеней [1011]. Также днРНК могут образовывать дуплексы с мРНК-мишенью, ингибируя ее трансляцию [12] или изменяя стабильность [1314]. Более того, некоторые длинные некодирующие РНК способны оказывать влияние на сплайсинг пре-мРНК [15, 16, 17].

Несмотря на небольшое количество охарактеризованных днРНК, ясно, что они могут играть роль в развитии многих заболеваний. Так, в базе данных lncRNADisease содержатся записи примерно из 500 научных публикаций о 321 днРНК, участвующей в развитии 221 заболевания [18]: среди них опухолевые, нейродегенеративные, сердечно-сосудистые патологии, болезни геномного импринтинга и многие другие. При этом в некоторых случаях днРНК играют главную роль в молекулярном патогенезе заболевания, что делает их не только перспективными биомаркерами, но и мишенями для терапии. В обзоре мы приводим наиболее интересные примеры использования днРНК в качестве потенциальных мишеней для терапии различных заболеваний, а также описываем существующие на сегодняшний день подходы генной терапии, которые могут быть направлены на модуляцию активности днРНК.

Терапевтические подходы, направленные на изменение активности днРНК

Развитие и прогрессирование различных заболеваний могут быть связаны как с активацией экспрессии длинных некодирующих РНК [3, 19, 20, 21, 22, 23], так и со снижением их содержания в клетке [24, 25, 26, 27, 28]. Поэтому на сегодняшний день активно развиваются подходы к генной терапии, направленные на активацию и подавление экспрессии днРНК, а также на ингибирование их активности. К методам активации экспрессии генов можно отнести экспрессию с векторов, как плазмидных, так и вирусных, а также использование искусственных ген-специфичных транскрипционных активаторов. Для подавления экспрессии генов днРНК можно использовать такие подходы, как РНК-интерференция, антисмысловые олигонуклеотиды (АСО), репрессия транскрипции и геномное редактирование. Ингибировать активность днРНК можно с помощью АСО или малых молекул.

Указанные выше методы были разработаны для генной терапии заболеваний, вызываемых изменениями в белок-кодирующих генах, но хорошо подходят и для днРНК. При этом арсенал методов воздействия на белок-кодирующие гены гораздо шире. Это связано с имеющимся на сегодняшний день большим объемом знаний о функционировании белков, тогда как о днРНК известно пока не так много. Большой потенциал для изучения имеют вторичные структуры, свойственные молекулам днРНК. Поэтому следует ожидать, что накопление знаний о функциях длинных некодирующих РНК в норме и при патологии приведет к разработке новых эффективных и высокоспецифичных методов генной терапии.

Ниже описаны принципы основных подходов, направленных на изменение экспрессии или активности длинных некодирующих РНК (рисунок).

Экспрессионные векторы

Использование экспрессионных векторов на сегодняшний день является самым распространенным методом увеличения экспрессии целевого гена как в научных исследованиях, так и в генной терапии. Существует большое количество различных векторов и способов их доставки в клетки (вирусных и невирусных) [29]. Данный подход активно используется для компенсации потери экспрессии функционального гена в результате возникновения в нем делеции или патогенной мутации.

Весьма перспективной является возможность использования ткане- или опухолеспецифических промоторов, что позволяет обеспечить специфичность экспрессии целевого гена. Например, известно, что промотор днРНК H19 активируется во многих опухолевых клетках. Таким образом, введение данного промотора в конструкцию, экспрессирующую гены-супрессоры опухолевого роста (как кодирующие, так и некодирующие), позволяет изменять их экспрессию только в тканях опухоли [30].

РНК-интерференция

РНК-интерференция — механизм подавления экспрессии генов при помощи малых молекул РНК. Такими молекулами являются малые интерферирующие РНК (siРНК) и микроРНК, представляющие собой РНК-дуплекс длиной 21–25 пар нуклеотидов. Одна из цепей малой РНК, называемая ведущей (guide strand), встраивается в комплекс RISC (RNA-induced silencing complex) и направляет его к своим РНК-мишеням. Это в итоге приводит к деградации целевой РНК или ингибированию ее трансляции.

Данный подход также является универсальным и пригоден для подавления экспрессии как белок-кодирующих генов, так и длинных некодирующих РНК. На сегодняшний день разрабатываются подходы к генной терапии с использованием siРНК и микроРНК или малых шпилечных РНК (shРНК) — предшественников siРНК, доставляемых в клетки в составе экспрессионного вектора. Несмотря на их высокую эффективность в подавлении экспрессии гена, использование механизма РНК-интерференции для терапии заболеваний часто сопряжено с проблемами доставки, специфичности и иммуногенности данных препаратов. Однако ведутся активные исследования, направленные на решение этих проблем, например с использованием химических модификаций малых РНК.

Антисмысловые олигонуклеотиды

Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО) — это малые синтетические молекулы ДНК или РНК, способные по принципу комплементарности связываться с РНК-мишенями, подавляя их экспрессию или влияя на их функцию. Наиболее часто используемым механизмом действия АСО является привлечение РНКазы Н, которая расщепляет молекулу целевой РНК в составе РНК–ДНК-гибрида [31]. Другим примером действия антисмысловых олигонуклеотидов является влияние на прохождение сплайсинга, при котором связывание АСО с участком пре-мРНК ведет к блокированию связывания с ней определенных факторов сплайсинга (splice-switching) [32]. В этом случае антисмысловые олигонуклеотиды синтезируют со специальными химическими модификациями, такими как пептидо-нуклеиновые кислоты (peptide nucleic acid, PNA) или морфолиновые олигонуклеотиды (phosphoramidate morpholino oligomer, PMO), в результате чего они не приводят к активации РНКаза Н- зависимого расщепления [33]. Для длинных некодирующих РНК также показан механизм блокирования их связывания с хроматин-модифицирующим комплексом PRC2 за счет связывания с АСО [21].

Кроме PNA- и PMO-модификаций олигонуклеотидов существуют и другие. Самыми распространенными из них являются LNA (Locked nucleic acid) и 2’-O-Methyl (2’-OMe)-модификации. Они повышают стабильность олигонуклеотида, а также его специфичность и аффинность связывания с РНК-мишенью. Кроме того, было показано, что LNA-модификация не влияет на способность молекул РНК встраиваться в комплекс RISC [33]. Таким образом, на сегодняшний день РНК-интерференция и использование антисмысловых олигонуклеотидов являются наиболее часто используемыми методами подавления экспрессии генов в клинической практике. По данным на 2016 г., 26 лекарственных препаратов на основе siРНК и АСО проходят различные стадии клинических испытаний для более чем 50 заболеваний [33].

Редактирование генома

Перспетикнвыми выглядят подходы геномного редактирования, позволяющие как исправить патогенную мутацию, так и провести нокаут гена. В случае длинных некодирующих РНК последний вариант кажется наиболее реализуемым (ниже будут приведены примеры заболеваний, возникающих при чрезмерной экспрессии днРНК).

Редактирование генома стало широкодоступным после исследования механизмов связывания с ДНК искусственно созданных белков типа «цинковые пальцы» (ZNF) [34] и затем белков-эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALENs) [35]. Эти подходы основаны на возможности определенных белковых последовательностей (мономеров) связываться с конкретными нуклеотидами в составе двуцепочечной ДНК. Чередование таких мономеров позволяет создать белок, связывающийся с заданной (желаемой) последовательностью ДНК. При этом каждый мономер ZNF узнает последовательность из трех нуклеотидов, тогда как мономер TALEN распознает отдельные нуклеотиды, что делает последний метод гораздо более универсальным.

Однако немного позже начала активно использоваться еще одна система редактирования генома — CRISPR (Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats). В отличие от предыдущих систем узнавание целевой последовательности ДНК системой CRISPR осуществляется за счет комплементарного связывания направляющей РНК (small guide RNA, sgРНК) с ДНК и привлечения нуклеазы Cas9, способной расщеплять двуцепочечную ДНК. Система CRISPR/Cas9 является значительно более эффективной и простой в применении, чем ZNF или TALEN [36]. Поэтому на сегодняшний день она является самым распространенным методом редактирования генома и решения других задач [37]. И хотя до сих пор ведутся споры относительно допустимости ее использования в клинической практике из-за недостаточной специфичности [38, 39, 40], многие группы ученых ведут исследования по оптимизации и разработке подходов к генной терапии на основе системы CRISPR/Cas9.

Регуляция транскрипции

Кроме как для редактирования генома, технология CRISPR/Cas9 может быть использована для изменения экспрессии генов без вмешательства в структуру ДНК. Для этого в последовательность нуклеазы Cas9 были внесены мутации, инактивирующие ее нуклеазную активность, а получившийся белок назвали dCas9 (deactivated Cas9). К нему можно присоединять различные белковые домены, активирующие (CRISPRa: VP64, p65, Rta) или репрессирующие (CRISPRi: KRAB, ZNF10) транскрипцию, и таким образом влиять на экспрессию генов [41, 42, 43, 44]. Использование данных систем показало свою эффективность на клеточных культурах. Например, Gilbert и соавт. применили систему dCas9-KRAB для репрессии транскрипции 5 днРНК, вовлеченных в канцерогенез (H19, MALAT1, NEAT1, TERC, XIST). При этом экспрессия РНК-мишеней снижалась более чем на 80 %, что не уступает по эффективности РНК-интерференции или использованию АСО [45]. В то же время Perez-Pinera и соавт. показали возможность усиления транскрипции различных белок-кодирующих генов в 2–250 раз с применением системы dCas9-VP64 [44].

Использование подходов CRISPRa/i имеет ряд преимуществ перед РНК-интерференцией и экспрессионными векторами. Во-первых, только система CRISPRa/i позволяет модулировать функцию РНК in cis. Известно, что часто некодирующие РНК проявляют свою функцию в локусе транскрипции, а иногда именно сам процесс транскрипции днРНК важен для регуляции экспрессии соседних генов [21, 28, 46]. Во-вторых, активация эндогенного промотора будет приводить к экспрессии всех альтернативных изоформ РНК в их необходимых соотношениях [47]. Впрочем, существует и ряд ограничений применения систем на основе CRISPR для регуляции работы длинных некодирующих РНК, так как они часто перекрываются с одним или несколькими белок-кодирующими генами или имеют с ними общую промоторную область. Поэтому изменение транскрипции таких днРНК может привести к нежелательному влиянию на экспрессию соседних генов [47].

Влияние на активность днРНК при помощи малых молекул

Другим подходом к терапии заболеваний, развитие которых связанно с днРНК, является использование малых молекул, препятствующих взаимодействию днРНК с их белковыми партнерами [48, 49]. С помощью высокопроизводительного скрининга можно выявлять малые молекулы, препятствующие образованию комплекса днРНК–белок и в дальнейшем использовать эти молекулы для лечения заболеваний [50]. По сравнению с другими генно-терапевтическими агентами малые молекулы лучше доставляются и поглощаются клетками. Известные взаимодействия между днРНК и белком, такие как HOTAIR–PRC2, ANRIL–CBX7, PCAT-1–PRC2 и H19–EZH2 стали привлекательными мишенями для скрининга ингибиторов малых молекул [51]. Например, в работе Zhou и соавт. две малые молекулы, DZNEP и 2-PCPA, были использованы для ингибирования взаимодействия днРНК HOTAIR с белками PRC2 и LSD1 для изучения роли HOTAIR в развитии глиобластомы [52].

Примеры днРНК — потенциальных мишеней для терапии различных заболеваний

днРНК SAMSSON в развитии меланомы

 

 

Меланома — злокачественная опухоль, образующаяся из пигментных клеток кожи, меланоцитов. Для меланомы характерен повышенный риск образования метастазов [53]. По статистике, приведенной Американским онкологическим обществом (American cancer society), на меланому приходится около 4–6 % всех вновь выявляемых случаев рака [54].

В 2016 г. в работе Leucci и соавт. [3] были проведены обширные исследования роли длинной некодирующей РНК SAMSSON в развитии меланомы и возможности использования этой днРНК в качестве мишени для терапии. Основываясь на данных проекта The Cancer Genome Atlas (TCGA), авторы продемонстрировали, что данная днРНК имеет эктопическую экспрессию более чем в 90 % образцов меланомы. Более того, экспрессия данной РНК является меланомоспецифической. В дальнейшей экспериментальной работе было показано, что экспрессия SAMSSON активируется при воздействии известного меланомоспецифического транскрипционного фактора SOX10. При этом нокдаун SAMSSON с использованием LNA-модифицированных олигонуклеотидов в меланомных клеточных культурах приводил к значительному снижению скорости роста клеток и усилению апоптоза. Также исследователи показали, что SAMSSON напрямую взаимодействует с белком p32, а нокдаун SAMSSON приводит к снижению митохондриальной фракции p32. Это, в свою очередь, приводит к нарушению синтеза белков дыхательной цепи митохондрий, снижению потенциала мембраны митохондрий и апоптозу. Кроме того, снижение количества p32 в митохондриях приводит к накоплению «токсичных» предшественников митохондрий, что также индуцирует гибель клеток.

Таким образом, SAMSSON является хорошей таргетной мишенью для терапии меланомы. Для демонстрации этого Leucci и соавт. провели исследование in vivo. Мышам прививали ксенографтные опухоли меланомы. После чего внутривенно вводили модифицированный антисмысловой олигонуклеотид против днРНК SAMSSON. Использование целевого олигонуклеотида приводило к значимому снижению темпов роста опухоли по сравнению с контролем: примерно в 1,5 раза. Кроме того, использование данного олигонуклеотида в комбинации с дабрафенибом (селективным ингибитором киназы BRAF с мутацией V600E) приводило к значительному — более чем в 2 раза — усилению терапевтического эффекта последнего. Таким образом, исследователи пришли к выводу, что днРНК SAMSSON может быть использована как информативный биомаркер меланомы, а также как перспективная мишень для терапии данного заболевания.

днРНК BCAR4 в развитии рака молочной железы 

Опухоль молочной железы — самое распространенное опухолевое заболевание среди женщин. При этом в структуре смертности от опухолевых заболеваний у женщин рак молочной железы стоит на втором месте (14 %). В работе Xing и соавт. [19] было продемонстрировано, что экспрессия днРНК BCAR4 не детектируется в нормальных тканях молочной железы, но присутствует более чем в половине образцов опухолей молочной железы. При этом уровень экспрессии BCAR4 возрастает на стадии метастазирования в лимфатические узлы, а ее повышенная экспрессия коррелирует со снижением кумулятивной выживаемости пациентов. Кроме того, предыдущие исследования других авторов показали, что экспрессия BCAR4 активируется в клетках опухоли в ответ на лечение тамоксифеном, что делает клетки нечувствительными к дальнейшей терапии антиэстрогеновыми препаратами [55].

Xing и соавт. [19] показали также, что нокдаун гена BCAR4 в клеточных линиях опухоли молочной железы приводит к значительному снижению уровня миграции и инвазии клеток, но не к снижению их пролиферации. Используя методики аффинной очистки лизатов и масс-спектрометрии, исследователям удалось установить, что днРНК BCAR4 напрямую взаимодействует с белками SNIP1 и PNUTS. При этом было выявлено, что BCAR4 через SNIP1 образует комплекс с фосфорилированным белком GLI2. GLI2 является транскрипционном фактором, регулирующим транскрипцию генов клеточной миграции и инвазии через активацию сигнального пути Hedgehog. С помощью ChiRP-анализа (Chromatin isolation by RNA purification) была выявлена локализация транскрипта BCAR4 в области промотора гена-мишени GLI2, при этом нокдаун гена BCAR4 приводил к снижению экспрессии транскрипционного фактора.

Также было установлено, что данная днРНК при взаимодействии с белком PNUTS образует комплекс с фосфатазой PP1, которая, в свою очередь, дефосфорилирует РНК-полимеразу II, что необходимо для ее нормального функционирования. Таким образом, было показано, что днРНК BCAR4 является важным участником комплекса, активирующего транскрипцию генов-мишеней GLI2, что на клеточном уровне приводит к активизации миграции и инвазии клеток опухоли.

В конце своей работы Xing и соавт. продемонстрировали терапевтический эффект нокдауна BCAR4 in vivo. У мышей моделировали активно метастазирующую опухоль с использованием ксенографта. Далее мышам внутривенно вводили по отдельности 2 различных модифицированных антисмысловых олигонуклеотида (LNA) против BCAR4 и сравнивали с контрольной неспецифичной (scramble) LNA. У мышей, обработанных таргетными LNA, значительно снижалось легочное метастазирование относительно контроля. При этом размер первичной опухоли не изменялся.

Кроме того, исследователи использовали другой подход для лечения мышей: инъекции таргетных shRNA в жировую ткань непосредственно молочной железы. При таком воздействии также наблюдалось значительное снижение уровня метастазирования в легкие при том же размере первичной опухоли. Однако в последнем случае эффект был более выраженным, чем при внутривенном введении LNA. Xing и соавт. предлагают использовать экспрессию BCAR4 как важный прогностический признак прогрессии опухоли молочной железы и как мишень для ингибирования метастазирования опухоли у пациентов с высоким риском метастазирования и у пациентов с развившейся резистентностью к антиэстрогеновым препаратам.

днРНК HOTAIR в развитии различных опухолевых заболеваний 

HOTAIR (Hox transcript antisense intergenic RNA) — одна из первых некодирующих РНК, для которой было показано участие в развитии опухолевых заболеваний [7]. HOTAIR транскрибируется с антисмысловой цепи кластера генов HOXC на хромосоме 12 и способна привлекать к другому кластеру гомеобоксных генов, HOXD, репрессирующие комплексы белков PRC2 (polycomb repressive complex 2) [7] и LSD1 (lysine-specific demethylase 1) [8]. При этом активность комплекса PRC2 приводит к метилированию гистона H3K27, а активность комплекса LSD1 — к деметилированию H3K4me2, что приводит к подавлению транскрипции генов-мишеней. В последующих работах было показано, что HOTAIR способна привлекать PRC2-комплекс не только к генам HOXD, но и множеству других генов. В том числе к гену рецептора прогестерона PGR, к генам семейства протокадгеринов (PCDH10, PCDHB5, PCDH20), генам, вовлеченным в опухолевый ангиогенез — EPHA1 и JAM2 [56], а также генам-супрессорам опухолевого роста (PTEN [7]).

Было показано, что экспрессия HOTAIR в метастазах опухоли молочной железы увеличена в сотни раз [56], тогда как уровень ее экспрессии в первичной опухоли достаточно гетерогенен. Анализ первичных опухолей показал, что высокий уровень экспрессии HOTAIR является значимым прогностическим признаком развития метастазов и снижения выживаемости пациентов. Кроме того, в экспериментах на клеточных культурах и in vivo на мышах было показано, что увеличение экспрессии HOTAIR ведет к увеличению инвазивной активности клеток опухоли и развитию метастазов в легких. Например, Gupta и соавт. подсаживали мышам опухолевую клеточную линию MDA-MB-231, содержавшую вектор, оверэкспрессирующий HOTAIR, или контрольный пустой вектор. Первичный размер опухоли у мышей с оверэкспресией HOTAIR был значимо, но несильно увеличен по сравнению с контролем, тогда как уровень метастазирования в легкие при увеличении экспрессии HOTAIR возрос в 4 раза [56].

В дальнейшем была показана роль HOTAIR в развитии целого ряда опухолевых заболеваний, таких как сквамозно-клеточный рак пищевода, немелкоклеточный рак легких, рак желудка, гепатоцеллюлярная карцинома, рак эндометрия, рак простаты, назофарингеальная карцинома, сквамозно-клеточный рак гортани, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, меланома, глиома, саркома. Причем в большинстве случаев повышенная экспрессия HOTAIR коррелирует с активностью метастазирования и ухудшением прогноза течения заболевания [57].

В связи с этим HOTAIR может являться мишенью для эффективной терапии некоторых опухолевых заболеваний, особенно с неблагоприятным прогнозом. Действительно, на сегодняшний день, существует ряд работ, сообщающих об экспериментах in vivo на ксенографтных мышиных моделях, в которых снижение экспрессии HOTAIR приводило к значительному торможению роста опухоли. Например, в работе Li и соавт. были проведены эксперименты с мышиной моделью сквамозно-клеточного рака гортани. Животным подкожно вводили клетки Hep-2, после чего у них развивались опухоли. В дальнейшем проводили внутриопухолевые инъекции лентивирусного вектора, содержавшего shRNA против HOTAIR. В результате размер опухоли после введения целевой shRNA был значительно ниже по сравнению с контрольной группой (1,113 ± 0,209 г против 1,960 ± 0,584 г соответственно) [58].

днРНК MALAT1 в развитии различных опухолевых заболеваний

 

Длинная некодирующая РНК MALAT1 (Metastasis associated in lung adenocarcinoma transcript 1) была впервые описана еще в 1997 г., однако свое нынешнее название получила только в 2003 г. Тогда Ji и соавт. показали, что ее экспрессия ассоциирована с развитием метастазов у пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Это была первая днРНК, для которой была описана ее роль в развитии опухолевых заболеваний [59]. При этом MALAT1 экспрессируется на высоком уровне во многих нормальных тканях человека и является консервативной среди млекопитающих [59]. В дальнейшем было показано, что MALAT1 локализуется в основном в ядре клетки в составе nuclear speckles [15].

Оказалось, что MALAT1 способна образовывать комплексы с SR-белками сплайсинга и изменять их локализацию в ядре, а также модулировать фосфорилирование белков SF2/ASF. Более того, Tripathi и соавт. продемонстрировали, что нокдаун MALAT1 в клеточной линии аденокарциномы шейки матки Hela приводит к изменению альтернативного сплайсинга многих генов [16]. Хотя в других исследованиях, проведенных на клеточных линиях опухолей легкого (A549, WT, GFP, KO1-3), не было показано значимое влияние нокдауна MALAT1 на альтернативный сплайсинг [60]. Кроме того, мыши, нокаутные по MALAT1, нормально развиваются и не демонстрируют никакого патологического фенотипа или даже изменения в локализации SR-белков. Такое несовпадение полученных результатов может быть связано с тем, что MALAT1 может выполнять различные функции у мыши и человека, или с тем, что для проявления фенотипического влияния MALAT1 необходимы какие-либо специальные, возможно, стрессовые, условия [20, 61].

Тогда как вопрос о влиянии MALAT1 на альтернативный сплайсинг остается дискуссионным, участие этой днРНК в регуляции экспрессии генов-мишеней не вызывает сомнений. В работе Tano и соавт. было продемонстрировано, что нокдаун MALAT1 в клеточной линии легочной карциномы A549 значительно снижает экспрессию генов (CTHRC1, CCT4, HMMR, ROD1 и др.), отвечающих за клеточную миграцию, что приводит к снижению уровня подвижности клеток [62]. Расширенное исследование других авторов, проведенное на нескольких клеточных линиях, также продемонстрировало роль MALAT1 в активации экспрессии генов, приводящих к метастазированию опухолей (GPC6, LPHN2, CDCP1 и ABCA1). При этом уровень экспрессии генов-ингибиторов миграции и инвазии клеток (MIA2, ROBO1) при нокдауне MALAT1 увеличивался [60]. Возможный механизм влияния MALAT1 на экспрессию генов был описан в работе Yang и соавт. где было показано, что MALAT1 способна образовывать комплекс с белком Pc2, причем только с неметилированной его фракцией, тогда как метилированная фракция Pc2 взаимодействует с другой днРНК, TUG1, и входит в состав комплекса PRC1 (polycomb repressive complex 1) [5].

Уже в самых первых работах была показана роль MALAT1 в развитии метастазов опухолей легкого человека [5962]. В дальнейшем была продемонстрирована роль аберрантной экспрессии MALAT1 во многих видах опухолей, включая рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак шейки матки, колоректальный рак, рак эндометрия, рак пищевода, рак желудка, гепатоцеллюлярную карциному, меланому, нейробластому, остеосаркому, рак яичников, рак простаты, аденому гипофиза, миеломную болезнь и рак почки [20].

Все вышеперечисленное делает MALAT1 перспективной мишенью для терапии различных опухолей с целью предотвращения их метастазирования. В работе Gutschner и соавт. была исследована модель метастазирования клеток опухоли легкого человека у мыши in vivo. Для этого мышам прививали подкожно первичную опухоль, состоявшую из клеток человека EBC-1. После чего делили животных на 2 группы: одной группе подкожно вводили антисмысловой олигонуклеотид против MALAT1, а второй — контрольный АСО. В результате было показано, что размер первичной опухоли не отличался в двух группах, тогда как количество и размер метастазов в легкие были меньше в группе мышей с введенным АСО к MALAT1. Исходя из результатов эксперимента, авторы делают вывод, что нокдаун MALAT1 в опухоли может быть эффективным для предотвращения метастазирования опухоли [60].

днРНК BACE1-AS в развитии болезни Альцгеймера

 

Болезнь Альцгеймера — наиболее частая форма возрастной деменции; нейродегенеративное заболевание, проявляющееся в виде нарушений памяти, речи и когнитивных способностей. В основе заболевания лежит гибель нейронов в результате внеклеточного накопления β-амилоидных бляшек, повреждающих клетки [63]. Ведущую роль в формировании амилоидных бляшек играет белок BACE1 (β-site APP-cleaving enzyme 1). Данный белок является β-секретазой и расщепляет белок-предшественник APP до β-амилоида, образующего бляшки [64].

BACE1-AS — некодирующая РНК длиной около 2 тыс. оснований, транскрибируемая с противоположной цепи локуса BACE1 (11q23.3). Данная днРНК содержит участок длиной 106 нуклеотидов, полностью комплементарный экзону 6 мРНК BACE1. Faghihi и соавт. исследовали участие BACE1-AS в патогенезе болезни Альцгеймера, наблюдая за экспрессией BACE1 [13]. Специфический нокдаун BACE1-AS в клеточной линии нейробластомы человека (SH-SY-5Y) приводил к значительному снижению уровня не только самой BACE1-AS, но и ее антисмыслового партнера BACE1, а также белка β-секретазы. С другой стороны, увеличение экспрессии BACE1-AS сопровождалось увеличением уровня BACE1 как на уровне РНК, так и на уровне белка. Кроме того, исследователи показали, что BACE1 и BACE1-AS формируют РНК–РНК-дуплекс, образование которого приводит к увеличению стабильности мРНК BACE1. При этом различные стрессовые воздействия на клетки, в том числе и их обработка амилоидными бляшками, приводят к совместному повышению уровня экспрессии BACE1 и BACE1-AS.

Полученные данные также подтверждает тот факт, что у пациентов c болезнью Альцгеймера уровень экспрессии BACE1-AS в пораженных областях мозга в 2–6 раз выше, чем в контрольных образцах. Таким образом, при болезни Альцгеймера различные клеточные стрессы приводят к повышению экспрессии днРНК BACE1-AS, которая образует дуплекс с мРНК BACE1, тем самым повышая ее стабильность. В результате растет содержание β-секретазы и происходит накопление амилоидных бляшек, что, в свою очередь, еще больше повышает уровень экспрессии BACE1-AS, замыкая порочный круг.

Основываясь на предыдущем исследовании, авторы выдвинули гипотезу о возможности использования siRNA против BACE1-AS и BACE1 для терапии болезни Альцгеймера in vivo [65]. Для этого использовали трансгенных мышей Tg-19959, в клетках которых синтезировался человеческий мутантный белок APP. Животным была имплантирована осмотическая минипомпа в третий желудочек головного мозга и затем в течение 14 дней им вводили LNA-модифицированные siRNA против BACE1 и BACE1-AS раздельно и совместно. В результате все три варианта нокдауна привели к значительному снижению уровня BACE1, а самым эффективным подходом оказался нокдаун обоих транскриптов одновременно: уровень BACE1 снижался до 60 % от исходного уровня. Далее авторы исследовали влияние нокдауна BACE1-AS на уровень нерастворимого бета-амилоида in vivo. После 14-дневной инфузии siRNA против BACE1-AS в тканях гиппокампа был измерен уровень β-амилоида. Было показано, что использование siРНК против BACE1-AS приводит к значительному снижению содержания нерастворимого β -амилоида в тканях гиппокампа исследуемых мышей, тогда как уровень растворимого амилоида не изменялся. Faghihi и соавт. подчеркивают, что BACE1 и BACE1-AS могут быть полезны в качестве мишеней для терапии болезни Альцгеймера.

днРНК SMN-AS1 в развитии спинальной мышечной атрофии

 

Спинальная мышечная атрофия (СМА) — это аутосомно-рецессивное наследственное заболевание, характеризующиеся прогрессивной гибелью нейронов передних рогов спинного мозга и проявляющееся симметричной мышечной слабостью и атрофией [66]. Причиной СМА является делеция или мутация в гене SMN1 (Survival Motor Neuron 1) [67]. Известно, что у человека в результате дупликации гена SMN1 образовался ген SMN2. Последовательность последнего практически идентична исходной последовательности, но содержит однонуклеотидную замену в экзоне 7, из-за чего происходит нарушение сплайсинга пре-мРНК SMN2, а ее экзон 7 не включается в зрелую мРНК. Следствием этого является образование укороченного нестабильного белка, хотя при этом около 10–20 % пре-мРНК SMN2 сплайсируются правильно и в результате образуется зрелый белок, идентичный продукту гена SMN1 [6869].

У человека ген SMN2 расположен в нестабильной хромосомной области, которая часто подвергается процессам дуплицирования, делетирования и генной конверсии. Из-за этого количество копий гена SMN2 у людей может варьировать [7]. При этом больные СМА с большим числом копий 0SMN2 имеют более мягкую форму заболевания [6]. Для СМА I типа с 1–2 копиями гена71SMN2 характерен наиболее ранний дебют и смерть в возрасте до 2 лет. При СМА III и IV типов в геноме присутствуют 3 или более копии гена SMN2, при этом болезнь характеризуется юношеским или взрослым дебютом и менее быстрым прогрессированием [72].

Таким образом, методы, направленные на повышение эндогенного содержания SMN2, могут привести к значительному улучшению состояния больных с СМА. Такой подход к терапии СМА был описан в работе Woo и соавт. [21]. Исследователи проанализировали общедоступные данные ChIP-seq (иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием) из проекта ENCODE и сделали вывод о том, что репрессионный комплекс PRC2 связывается с геномным локусом SMN2. Далее авторы проводили эксперименты на первичных клеточных культурах фибробластов больных СМА. Было показано, что нокдаун белков EZH1 и EZH2, входящих в состав комплекса PRC2, приводит к более чем двукратному увеличению содержания полноразмерной мРНК SMN с экзоном 7.

Woo и соавт. также обнаружили ранее неисследованную днРНК, транскрибируемую с локуса SMN, которую они назвали SMN-AS1 (SMN-Antisense 1). Из-за высокой степени гомологии между локусами генов SMN1 и SMN2 авторы предположили, что SMN-AS1 транскрибируется с обоих локусов. И действительно, методом ОТ-ПЦР была установлена зависимость между уровнем экспрессии SMN-AS1 и количеством копий гена SMN2 в геноме. Кроме того, авторы показали, что SMN-AS1 способна привлекать в геномные локусы SMN комплекс PRC2, подавляющий транскрипцию генов, т. е. SMN-AS1 негативно регулирует уровень SMN-транскриптов.

Вышесказанное означает, что снижение активности SMN-AS1 можно использовать в качестве подхода для терапии СМА. В рассматриваемой работе авторы предложили метод, основанный не на модуляции уровня днРНК в клетке, а на блокировании ее взаимодействия с PRC2-комплексом. Этого достигали путем добавления LNA-модифицированных АСО, комплементарных участку связывания SMN-AS1 с PRC2. Введение таких LNA в первичные фибробласты больных СМА привела к увеличению содержания полноразмерного продукта гена SMN в 6 раз. А РНК-иммунопреципитация (RIP) подтвердила нарушение взаимодействия SMN-AS1 с белками PRC2-комплекса. При этом эффект применения LNA был специфичным и мало влиял на взаимодействие других днРНК с PRC2. К тому же было показано, что повышение содержания полноразмерного SMN зависело от концентрации LNA. Схожие результаты авторами были получены и на модели нейрональных клеток больных СМА.

Кроме того, Woo и соавт. исследовали эффект использования LNA против SMN-AS1 совместно с другими ранее описанными АСО, корректирующими сплайсинг гена SMN2 [73]. В результате было установлено, что обработка клеток двумя антисмысмысловыми олигонуклеотидами приводит к двукратному увеличению содержания полноразмерной мРНК SMN2 по сравнению с использованием только корректора сплайсинга. Содержание функционального белка SMN при этом также увеличивалось. Таким образом, совмещая два подхода, можно получить максимальный терапевтический эффект.

днРНК HTTAS в развитии болезни Гентингтона

 

Боле

КОММЕНТАРИИ (0)