ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Определение частоты встречаемости мутаций в гене PAH с применением комбинации технологий ПЦР «в реальном времени» и высокопроизводительного секвенирования у больных фенилкетонурией Московского региона

А. И. Никифорова1, Д. Д. Абрамов1, В. В. Кадочникова1, Г. Ю. Зобкова1, К. А. Огурцова2, Н. О. Брюханова2, Е. А. Шестопалова2, Т. О. Кочеткова3, Е. С. Шубина, А. Е. Донников1, Д. Ю. Трофимов1
Информация об авторах

1 ООО «ДНК-Технология», Москва, Россия

2 Морозовская детская городская клиническая больница, Москва

3 Лаборатория молекулярно-генетических методов,
Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика
В. И. Кулакова, Москва

Для корреспонденции: Никифорова Алёна Игоревна
Каширское ш., д. 24, г. Москва, 115478; ur.ygolonhcet-and@avorofikin

Информация о статье

Вклад авторов в работу: А. И. Никифорова — планирование исследования, проведение NGS-секвенирования, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика и редактирование рукописи; Д. Д. Абрамов — планирование исследования, разработка диагностической панели, анализ и интерпретация данных, редактирование рукописи; В. В. Кадочникова — проведение ПЦР-исследования, анализ данных; Г. Ю. Зобкова — анализ литературы, интерпретация данных, редактирование рукописи; К. А. Огурцова, Н. О. Брюханова — сбор и анализ данных; Е. А. Шестопалова — планирование исследования, сбор и анализ данных, редактирование рукописи; Т. О. Кочеткова — проведение NGS-секвенирования, анализ данных; Е. С. Шубина — биоинформатический анализ данных, редактирование рукописи; А. Е. Донников — планирование исследования, интерпретация данных, редактирование рукописи; Д. Ю. Трофимов — планирование исследования, концепция и дизайн NGS-секвенирования.

Статья получена: 07.08.2017 Статья принята к печати: 16.08.2017 Опубликовано online: 30.10.2017
|

Патогенные мутации в гене фенилаланингидроксилазы (PAH) являются причиной тяжелого заболевания — фенилкетонурии (ФАГ-зависимой ФКУ, фенилкетонурии I типа). Данное заболевание имеет аутосомно-рецессивный тип наследования и входит в число распространенных наследственных заболеваний, рекомендовано ВОЗ для ранней диагностики у новорожденных. В России средняя частота фенилкетонурии составляет 1 : 7000 [1]. Заболевание обусловлено недостаточной активностью фермента печени фенилаланингидроксилазы (ФАГ), отвечающего за превращение фенилаланина (ФА) в тирозин. В результате нарушения работы ФАГ в организме повышается уровень содержания ФА и его производных, снижается уровень содержания тирозина, нарушается обмен других аминокислот [1, 2]. При отсутствии лечения признаки поражения ЦНС появляются в первом полугодии жизни. Своевременная диагностика и терапия позволяют избежать драматических последствий фенилкетонурии.

С целью ранней диагностики ФКУ у всех новорожденных в РФ биохимическими методами определяют уровень содержания ФА в крови [1, 2]. При выявлении гиперфенилаланинемии (ГФА), т. е. при содержании ФА выше 2 мг/дл (0,12 ммоль/л), проводится повторная и дифференциальная диагностика форм заболевания. Генетическая диагностика больных ФКУ выполняется с целью уточнения клинического диагноза, определения варианта генотипа по гену PAН. Мутации гена PAH в зависимости от их локализации и функционального типа по-разному влияют на свойства фермента ФАГ [1, 3, 4, 5, 6]. Тяжелые формы заболевания обусловлены изменениями в последовательности гена PAH, приводящими к нарушению синтеза белка или образованию фермента с нулевой остаточной активностью. Мутация p.R408W\с.1222C>T — наиболее распространенная среди населения России [1, 3, 6, 7, 8, 9, 10] — является примером «тяжелой» мутации гена PAH, в гомозиготном состоянии p.R408W\с.1222C>T приводит к синтезу ФАГ с минимальной остаточной активностью. Недавно было установлено, что препараты из группы синтетических аналогов тетрогидробиоптерина (природного кофермента ФАГ, НВ4), применяемые при терапии НВ4-зависимых форм ГФА, понижают уровень содержания ФА в крови пациентов с классической формой заболевания, но при условии сохранения остаточной активности фермента. Медикаментозное лечение в этом случае позволяет смягчить клинические проявления заболевания, расширить диету пациента. Таким образом, генетическая диагностика больных ФКУ является условием выбора стратегии индивидуальной терапии.

Существуют различные подходы генетической диагностики ФКУ. В целях выявления частых мутаций в гене PAH применяют методы выборочной диагностики, основанные на различных вариантах ПЦР и ПЦР-ПДРФ (полимеразная цепная реакция с последующим анализом полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) [6, 7, 8]. Перспективными являются разработки на основе метода мультиплексной лигазозависимой амплификации зондов (multiplex ligation-depend probe amplification, MLPA) [9], а также ПЦР в режиме «реального времени» (real-time PCR), в частности, на основе метода примыкающих проб (adjacent probes) [10]. Данные подходы позволяют проводить единовременную идентификацию десятков вариантов изменений последовательности гена. Тем не менее диагностическая эффективность методов выборочной генетической диагностики, как правило, не превышает 70–80 % [7, 8]. Поиск редких мутаций (с частотой встречаемости менее 1 %) и новых вариантов гена эффективно осуществляется с помощью методов секвенирования [3, 4, 6, 11], обеспечивающих максимальную информативность при исследовании целевого региона последовательности гена. Актуальной проблемой является разработка и внедрение в практику рутинного применения отечественных решений для диагностирования ФКУ и других форм ГФА с использованием технологий секвенирования нового поколения (next-generation sequencing, NGS).

Целью настоящей работы стало определение мутаций в гене PAH у 71 ребенка из Московского региона с диагнозом «классическая фенилкетонурия» или «гиперфенилаланинемия». Для выявления частых вариантов мутации в гене была применена оригинальная технология определения нуклеотидных замен на основе метода real-time PCR с анализом кривых плавления, редкие и неучтенные генетические варианты в ПЦР-исследовании определяли методом таргетного секвенирования нового поколения (NGS).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В исследовании участвовали дети (n = 71) с клиническим диагнозом «классическая фенилкетонурия» или «гиперфенилаланинемия» (69 и 2 пациента соответственно), наблюдавшиеся в Морозовской детской городской клинической больнице (г. Москва) в 2015–2016 гг. Диагнозы пациентов были установлены по результатам клинических наблюдений и данных биохимического анализа крови. Пациенты не состояли в родстве. На момент проведения исследования все пациенты были резидентами Московского региона. В этническом отношении исследованная группа больных более чем на 85 % была представлена русскими, около 15 % составили другие национальности, включая выходцев с Южного Кавказа, из Средней Азии, а также Восточной Азии (среди пациентов присутствовал этнический китаец). Исследование соответствовало требованиям Хельсинкской декларации 2003 г., родители дали письменное информированное согласие на участие детей в нем.

В исследовании использована цельная венозная кровь пациентов, из которой с помощью комплекта реагентов «ПРОБА-ГС-ГЕНЕТИКА» («НПО ДНК-Технология», Россия) выделяли геномную ДНК. Полученные образцы ДНК сразу использовали для генотипирования или хранили при –20 °С.

Примененная технология ПЦР-генотипирования является модификацией метода примыкающих проб (adjacent probes, kissing probes) [12]. В основе технологии лежит использование двух типов сиквенс-специфичных олигонуклеотидных зондов, гибридизующихся на ДНК-матрицу при низкой температуре в непосредственной близости друг от друга. Один из зондов несет источник флюоресценции, другой — гаситель флюоресценции. Зонд с источником флюоресценции является типирующим, для повышения надежности генотипирования одновременно используются два варианта типирующих зондов (соответствующих вариантам полиморфизма), меченных разными флуорофорами. После проведения серии ПЦР — амплификации целевой последовательности ДНК — температура реакционной смеси понижается, в результате зонды гибридизуются на матрице. Генотипирование осуществляется при температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидных зондов и фрагментов ДНК путем измерения уровня флуоресценции в режиме «реального времени». На рисунке представлены кривые, характерные для определенных генотипов (подробно технология описана в работе Сергеева и соавт. [13])

Для проведения исследования были использованы ранее апробированные праймеры и зонды для определения 16 мутаций гена PAH: p.R408W, p.R261Q, p.R158Q, IVS10nt546\c.1066-11G>A, IVS12+1G>A, p.Y414C, IVS4+5G>T, p.R252W, p.L48S, p.R261Ter, p.P281L, p.G188D, p.E280K, p.F331S, p.P279L, IVS2+5G>C. В перечень выявляемых мутаций вошли 8 вариантов, наиболее распространенных в России и рекомендованных к диагности- рованию [1]. ПЦР и определение температуры плавления олигонуклеотидных зондов проводили с помощью детектирующего амплификатора DTprime («НПО ДНК-Технология», Россия) по описанной ранее методике [10]. Продолжительность исследования составила 1,5 ч.

Образцы ДНК пациентов с неустановленным в результате поиска частых мутаций вариантом генотипа были исследованы методом таргетного высокопроизводительного секвенирования по технологии Ion Torrent (Thermo Fisher Scientific, США). Панель целевых участков гена PAH покрывала области экзонов (покрытие кодирующей последовательности гена составило 100 %), экзон-интронные границы, частично нетранслируемые регуляторные области гена. Суммарная длина исследуемых участков гена PAH составила 3 337 п. н. Целевые фрагменты гена амплифицировали в условии мультиплексной ПЦР. Для проведения реакции амплификации использовали не менее 10 нг геномной ДНК. Лигирование адаптеров к продуктам амплификации проводили с использованием T4 ДНК лигазы (Thermo Fisher Scientific, США) в соответствии с рекомендациями производителя. Контроль качества приготовления библиотек фрагментов ДНК для NGS-секвенирования осуществляли с помощью системы Agilent 2100 Bioanalyzer и набора Agilent High Sensitivity DNA Kit (Agilent Technologies, США). Секвенирование выполняли на приборе для проведения высокопроизводительного секвенирования Ion PGM System for Next-Generation Sequencing (Thermo Fisher Scientific) с использованием набора Ion PGM Template OT2 400 Kit того же производителя.

Первичный анализ данных осуществляли с помощью программного обеспечения Torrent Server 4.4.3. Выравнивание на референсный геном версии GRCh37/hg19 проводили с помощью программного модуля TMAP, для идентификации генетических вариантов был использован программный модуль Torrent Variant Caller 4.4. (Все перечисленное программное обеспечение произведено Thermo Fisher Scientific.) Последующий анализ проводили с помощью программных модулей, разработанных авторами. Среднее покрытие целевых фрагментов составило 7 300 прочтений, минимальное покрытие — 590, среднее количество прочтений на образец составило 95 500. Интерпретация патогенности генетических вариантов основана на анализе информации баз dbSNP Build 147, PAHvdb, BIOPKUdb [14] и данных литературы. В качестве подтверждающего метода проводили выборочное секвенирование ДНК по Сэнгеру на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США), использовали реактивы и рекомендации производителя. Во всех случаях были получены идентичные результаты генотипирования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На первом этапе исследования генотипирование пациентов проводили методом поиска частых мутаций в гене PAH с применением технологии real-time PCR. Из 16 вариантов, определяемых методом ПЦР-генотипирования, были вы- явлены 13: p.R408W, p.R261Q, p.R158Q, p.L48S, p.G188D, p.Y414C, p.R252W, IVS4+5G>T, p.R261Ter, IVS10nt546/ c.1066-11G>A, p.E280K, IVS12+1G>A, p.P281L (табл. 1). В 70,4 % случаев были идентифицированы мутации, затрагивающие оба аллеля гена PAH, у 25,4 % пациентов обнаружена мутация в одном из двух аллелей, в 4,2 % случаев патогенных мутаций обнаружено не было.

Для 21 одного случая с неустановленными изменениями в двух аллелях гена было выполнено исследование клинически значимых участков последовательности гена PAH методом высокопроизводительного секвенирования. В результате проведения секвенирования список патогенных вариантов гена PAH выборки был существенно расширен. Дополнительно обнаружены следующие варианты: p.D222Terfs, p.R111Ter, IVS11+1G>C, p.F161S, p.E390G, p.A300S, p.F55L, p.F55Leufs, p.R176Ter, p.L311P, p.R270K, IVS1+5G>T, IVS8-7A>G (табл. 1). Данные мутации описаны в мировой литературе, входят в реестр патогенных вариантов международной базы данных PAHvdb. Результаты исследования были подтверждены методом прямого секвенирования по Сэнгеру.

С помощью комбинированного подхода при проведении генетической диагностики PAH у 66 пациентов (93 % случаев) были выявлены 2 патогенные мутации, у 4 (5,6 %) пациентов — 1 мутация, у 1 (1,4 %) пациента мутаций не обнаружено.

Результаты по частотам встречаемости 26 патогенных вариантов выборки представлены в табл. 1. Мутации p.R408W и p.R261Q зарегистрированы с наибольшими частотами (соответственно выявлены у 54 и 12 пациентов в гомо- или гетерозиготном состоянии). Сравнительно частыми вариантами были IVS10nt546\c.1066-11G>A, IVS12+1G>A, p.R158Q, индивидуальные частоты встречаемости аллелей которых составили от 4,2 до 3,5 %, при этом данные мутации отмечены только в гетерозиготном состоянии. Половина патогенных вариантов, выявленных в исследованной выборке, зарегистрирована с суммарной частотой встречаемости менее 10 %. По итогам исследования описано 34 варианта генотипа гена PAH, у 21 пациента в одном или двух аллелях этого гена обнаружены мутации, при которых фермент ФАГ сохраняет более 10 % остаточной активности (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Частота встречаемости наиболее распространенной в России мутации p.R408W в исследованной нами выборке больных ФКУ составила 47,9 %. Данный показатель близок к среднему значению по регионам [9], существенно ниже значений для Ростовской [15], Кемеровской [11], Новосибирской [3] областей и Дальнего Востока [7, 9] России. Мутация p.R261Q, вторая по встречаемости в выборке (9,9 %), входит список наиболее распространенных на территории России [1, 3, 6, 7, 8, 15], является превалирующей в Карачаево-Черкесской Республике [16]. Оба варианта распространены в Европе, мутация p.R408W более характерна для стран Восточной Европы, мутация p.R261Q — одна из наиболее частых в странах Южной Европы, распространена в Нидерландах и Швейцарии [5]. В отличие от p.R408W мутация p.R261Q относится к числу «мягких» мутаций гена PAH.

Сравнительно часто в генотипах были выявлены распространенные в России мутации IVS10nt546, IVS12+1G>A, p.R158Q, p.Y414C, IVS4+5G>T, p.L48S, p.R252W (индивидуальные частоты встречаемости аллелей составили от 4,2 до 2,1 %). Мутация p.P281L была идентифицирована в гетерозиготном состоянии у 1 пациента выборки русского происхождения. В некоторых регионах России мутация p.P281L является одной из наиболее частых [3, 15, 17].

Мутации p.D222Terfs, p.R111Ter были выявлены в 3 генотипах каждая (частота аллелей составила 2,1 %) в состоянии компаунда с другими мутациями. Генетический вариант p.D222Terfs представляет собой делецию двух нуклеотидов GA в 664–665-м положениях, делеция приводит к сдвигу рамки считывания и синтезу более короткого белка. Данную мутацию ранее регистрировали в Европе [18]. Генетический вариант p.R111Ter представляет собой стоп-мутацию, также приводящую к синтезу укороченной молекулы ФАГ. Данная мутация сравнительно редко выявляется в странах Европы [5], но распространена среди больных ФКУ в КНР [19].

Мутации p.R261Ter и IVS11+1G>C представлены в выборке с частотой более 1 %. Мутация p.R261Ter была ранее зарегистрирована в различных регионах РФ [3, 11]. Нарушающая сплайсинг мутация IVS11+1G>C, редкая в РФ, ранее была выявлена у больных ФКУ в Кемеровской [11] и Ростовской [15] областях.

Другие мутации гена PAH (12 вариантов) были обнаружены в гетерозиготном состоянии по одному разу. Выявленные в выборке миссенс-мутации p.E280K, p.E390G, p.A300S и стоп-мутация p.R176Ter были ранее зарегистрированы в двух регионах РФ [3, 11]. Миссенс-мутация p.R270K ранее идентифицирована в Татарстане [20]. Мутация p.F161S впервые зарегистрирована в Северном Китае [21], по современным данным, выявляется среди больных ФКУ в КНР сравнительно редко [19]. Варианты p.L311P, p.F55L, p.F55Leufs, IVS1+5G>T, IVS8-7A>G описаны в европейских популяциях [18, 22, 23, 24, 25]. Редкий вариант p.G188D ранее зарегистрирован в КНР [26].

Разнообразие вариантов аллелей гена PAH в выборке, установленное в результате проведения целевого секвенирования гена, сопоставимо с данными литературы по Ростовской [15], Новосибирской [3] и Кемеровской [11] областям. Частоты встречаемости аллелей с «тяжелыми» и «мягкими» мутациями составили 73,8 и 20,4 % соответственно. Показатель встречаемости в генотипах пациентов «мягких» мутаций согласуется с данными Гундоровой и соавт. по Москве и Московской области на 2017 г. [9], полученное значение превышает усредненные показатели по регионам.

В исследовании представлен пилотный опыт применения адаптированной технологии real-time PCR определения нуклеотидных замен на основе метода примыкающих проб для выявления частых мутаций гена PAH в выборке больных ФКУ Московского региона. Метод не представляет сложности в использовании (все реакции и регистрация флуоресцентного сигнала выполняются на одном приборе отечественного производства), позволяет одновременно осуществлять диагностирование образца на наличие широкого ряда генетических вариантов за сравнительно короткие строки. Технология перспективна для проведения как научных исследований, так и для внедрения в практику рутинного медицинского диагностирования. По итогам исследования выборки диагностическая эффективность метода в отношении выявления носительства патогенного аллеля превысила 80 %. Список определяемых мутаций в гене PAH, включивший 16 вариантов, не окончательный, преимуществом технологии является возможность оперативного введения новых вариантов в состав диагностической панели.

Мутации с низкой частотой встречаемости в популяции не диагностируются методами выборочной генодиагностики. Спектр редких вариантов в конкретной популяции может быть достаточно широким, на сегодняшний день в гене PAH описано более 800 вариантов, при этом только несколько из них выявляются c частотой более 1 %. Применение целевого высокопроизводительного секвенирования при исследовании выборки позволило дополнительно идентифицировать 12,6 % патогенных аллелей. Были выявлены не описанные в России на момент проведения исследования мутации: p.D222Terfs, p.R111Ter, p.F161S, p.G188D, p.L311P, p.F55L, p.F55Leufs, IVS1+5G>T, IVS8-7A>G. Отметим, что варианты p.D222Terfs и p.R111Ter являются потенциальными кандидатами на включение в состав панели ПЦР-скрининга для проведения генотипирования в Московском регионе (мутации обнаружены у 3 разных пациентов русской национальности). В 7 % случаев нам не удалось обнаружить патогенные изменения в обоих аллелях гена PAH. Эти случаи требуют дополнительных генетических тестов, прежде всего, более глубокого исследования гена PAH, а также проведения диагностики с PAH-независимыми формами ФКУ, на долю которых приходится до 2–3 % случаев заболевания [1, 4].

ВЫВОДЫ

В результате исследования выборки неродственных больных с фенилкетонурией, наблюдавшихся в Морозовской ДГКБ (г. Москва) в 2015–2016 гг., выявлено широкое разнообразие патогенных мутаций, а также вариантов генотипов по гену PAH. Применение ПЦР для определения нуклеотидных замен в гене PAH в рамках исследования на 16 типах мутаций гена позволило идентифицировать 83 % патогенных аллелей в выборке. Технологический потенциал метода real-time PCR делает возможным его применение в практике для рутинного диагностирования частых мутаций в гене PAH у больных ФКУ и выявления носительства патогенных мутаций. Мутация p.R408W представляет мажорный вариант, полученное значение аллельной частоты по данной мутации соответствует современным данным для Москвы и Московской области. Выявленный спектр частых мутаций выборки совпадает с данными по России. Процент аллелей с «мягкими» мутациями в выборке больных ФКУ превышает средние значения по России. Мутации p.D222Terfs и p.R111Ter, выявленные в нескольких независимых случаях, являются потенциальными кандидатами на включение в состав панели тестов ПЦР-скрининга при проведении генотипирования в Московском регионе. В результате использования метода целевого высокопроизводительного секвенирования выявлен ряд не описанных ранее для региона мутаций различного функционального типа: p.D222Terfs, p.R111Ter, p.F161S, p.G188D, p.R270K, p.L311P, p.F55L, p.F55Leufs, IVS1+5G>T, IVS8-7A>G.

КОММЕНТАРИИ (0)