ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
Исследование долгосрочного эффекта высоких доз циклофосфамида на репертуар Т-клеточных рецепторов T-лимфоцитов периферической крови у пациентов с аутоиммунными васкулитами
Информация об авторах
1 Группа структурной организации Т-клеточного иммунитета, отдел геномики адаптивного иммунитета, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва
2 Первый Московский государственный медицинский университет имени И. М. Сеченова (Сеченовский Университет), Москва
Для корреспонденции: Ольга Владимировна Британова
ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, г. Москва, 117997; moc.liamg@natirblo
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена при поддержке Российского научного фонда, грант № 16-15-00149. В исследовании было использовано оборудование Центра коллективного пользования ИБХ РАН, поддержанного Министерством образования и науки России, идентификатор соглашения — RFMEFI62117X0018.
Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений.
Статья получена: 04.10.2017
Статья принята к печати: 25.10.2017
Опубликовано online: 14.01.2018
|
Препараты, обладающие иммуносупрессивными свойствами, нашли широкое применение в терапии аутоиммунных заболеваний. Для лечения патологий с потенциально тяжелым течением, таких как аутоиммунные васкулиты, часто применяют цитостатический препарат циклофосфамид (ЦФ), иммуносупрессивные свойства которого не до конца изучены. ЦФ преобразуется в печени в 4-гидроциклофосфамид, который легко проникает в клетки, где подвергается дальнейшим изменениям: формируется либо активное цитотоксическое вещество фосфорамид, либо — при высоком содержании альдегиддегидрогеназы — неактивное соединение карбоксифосфамид. Клетки лимфоидного ряда (Т, В и NK-клетки) содержат небольшое количество альдегиддегидрогеназы и быстро гибнут при терапии высокими дозами ЦФ. Однако недифференцированные клетки, участвующие в гемопоэзе, характеризуются высоким содержанием альдегиддегидрогеназы и оказываются крайне устойчивыми к действию ЦФ. Таким образом, препарат имеет выраженный иммуносупрессивный, но не миелоаблативный эффект, т. к. стволовые клетки крови сохраняются и в дальнейшем происходит восстановление гемопоэза без необходимости трансплантации костного мозга [1]. Клинически подтверждено, что использование ЦФ в высоких дозах приводит к ремиссии у больных с разными типами аутоиммунных заболеваний (острой апластической анемией, миастенией гравис, склеродермией и др.), но только у 10 % больных не наблюдается рецидив в течение 5 лет после курса ЦФ [2].
В литературе существуют указания на специфическое воздействие ЦФ на наивные Т-клетки. Так, в работе Gladstone и соавт. [3] приводятся данные о лечении больных, страдающих рассеянным склерозом, с помощью ЦФ. Авторы показали существенное снижение числа наивных Т-лимфоцитов CD45RA+CD4+ по сравнению c популяцией клеток памяти CD45RО+CD4+. Практически все пациенты сохранили свой иммунологический статус, в том числе устойчивость к перенесенным в детстве инфекциям, которая поддерживается клетками памяти, что свидетельствует об их меньшей чувствительности к ЦФ.
Развитие технологий высокопроизводительного секвенирования качественно изменило глубину анализа репертуара Т-клеточных рецепторов (T-cell receptors, TCR). Совмещение этого подхода с иммунофенотипированием ранее позволило нам сделать ряд выводов о возрастных изменениях в адаптивной иммунной системе. В частности, на когорте доноров разного возраста, включая образцы пуповинной крови и материал от людей старше 100 лет, нами было продемонстрировано, что выраженное снижение доли наивных Т-лимфоцитов в периферической крови коррелирует с уменьшением разнообразия репертуара TCR, а также был описан ряд структурных изменений в нем [4].
Механизмы, лежащие в основе развития васкулитов, остаются малоизученными. Основным маркером заболевания является наличие антител к цитоплазматическим компонентам нейтрофилов (anti-neutrophil cytoplasmic antibody, ANCA). В случае гранулематоза с полиангиитом (ГПА, гранулематоз Вегенера) показано наличие антител к протеиназе-3 (PR-3), а в случае эозинофильного гранулематоза с полиангиитом (ЭГПА, синдром Чарга–Стросса) и микроскопического полиангиита — антител к миелопероксидазе. Считается, что ANCA участвуют в патогенезе заболеваний, взаимодействуя с антигенной мишенью и приводя к дегрануляции нейтрофилов, в результате чего разрушается эндотелий, а затем и сам сосуд [5]. Т-клетки также принимают активное участие в патогенезе перечисленных патологий. У пациентов, страдающих ими, наблюдается повышение числа циркулирующих в периферической крови активированных CD4+ и CD8+ Т-лимфоцитов и увеличение содержания воспалительных факторов, связанных с их активацией. Также гранулемы обычно инфильтрированы активированными Т-клетками [6, 7]. На животных моделях было показано снижение скорости клубочковой инфильтрации при деплеции Т-лимфоцитов [8].
Остается открытым вопрос о том, как ЦФ действует на различные функциональные популяции клеток крови и каково его влияние на адаптивную иммунную систему в долгосрочной перспективе. В последние несколько лет были опубликованы работы с использованием новых технологий, которые посвящены роли ЦФ в восстановлении TCR после аллогенной трансплантации клеток крови и костного мозга. Показано, что прием высоких доз ЦФ на 3–4 сутки после трансплантации существенно снижает риск возникновения острой и хронической реакции «трансплантат против хозяина», а также вирусных инфекций в целом и лимфопролиферативных посттрансплантационных заболеваний, связанных с вирусом Эпштейна–Бара, в частности [9]. В исследовании Kanakry и соавт. показано, что первыми восстанавливаются эффекторные клетки памяти и разнообразие их существенно ниже по сравнению с разнообразием аналогичных клеток донора [10].
В данной работе методом высокопроизводительного секвенирования были исследованы репертуары TCR периферической крови 9 доноров, страдающих васкулитами и имевших в анамнезе прием циклофосфамида в высоких дозах. Акцент сделан на сравнение характеристик репертуара бета-цепей TCR пациентов и здоровых доноров и поиск характерных вариантов TCR либо высокопредставленных V-beta и J-beta сегментов TCR, сцепленных с патологией. Проведена оценка долгосрочного эффекта ЦФ, оказываемого на репертуар TCR периферической крови.
ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ
Подбор доноров
В рамках исследования сформировали две группы — группу пациентов и группу здоровых доноров (контрольная группа). В каждой группе выделили условные подгруппы молодых (24–35 лет) и пожилых (52–68 лет) людей. В группу молодых пациентов включили 4 человека (3 мужчины и 1 женщина), пожилых — 5 человек (все — женщины), в контрольную группу — 7 (4 мужчины и 3 женщины) и 14 (6 мужчин, 8 женщин) соответственно. Пациенты страдали васкулитами и получали активную иммуносупрессивную терапию циклофосфамидом в высоких дозах не менее чем за 3 года до начала исследования. Когорту здоровых доноров формировали из добровольцев.
Исследование было одобрено локальным этическим комитетом Национального научно-практического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева (Москва) (протокол № 2013-5/4). Все участники дали письменное информированное согласие на участие в исследовании.
Выделение мононуклеаров и иммунофенотипический анализ образцов периферической крови
У участников исследования получали по 8 мл периферической крови, которые использовали для клинического анализа крови, а также для иммунофенотипирования, которое проводили так, как описано в работе [11]. Брали 100 мкл цельной периферической крови, инкубировали ее с моноклональными антителами: анти-CD45RA-Fitc (eBioscience, Thermo Fisher Scientific, США), CD27-PC5 (eBioscience), CD4-PE (Beckman Coulter, США), CD8-eFluor 405 (eBioscience), — и лизировали раствором Optilyse-С (Beckman Coulter). Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре Cytomics CF500 (Beckman Coulter). Также из 6 мл периферической крови методом градиентного центрифугирования на фиколле («ПанЭко», Россия) выделяли мононуклеарную фракцию, которую использовали для дальнейших исследований.
Выделение тотальной РНК, получение библиотек кДНК TCR и их секвенирование
Тотальную РНК выделяли с помощью реагента Trizol (Invitrogen, США) по протоколу производителя. Количество выделенной РНК определяли по интенсивности флуоресценции интеркалирующего агента на QuBit 3 (Invitrogen), качество полученного препарата оценивали методом гель-электрофореза.
Библиотеки кДНК TCR получали так, как описано в работе [11]. Для синтеза кДНК бета-цепи TCR использовали набор реагентов Mint («Евроген», Россия) и 1,5 мкг РНК на одну реакцию синтеза. Реакцию проводили в соответствии с протоколом производителя. В зависимости от количества выделенной РНК число реакций синтеза для образца варьировало от 4 до 6. Структура праймеров для синтеза и свитч-адаптера, а также программа амплификации описаны в статье [11]. В последовательность свитч-адаптера были введены 12 случайных нуклеотидов для уникального баркодирования каждой синтезированной молекулы кДНК. Схема эксперимента приведена на рис. 1.
Полученную кДНК амплифицировали, объединяли, очищали на колонках Cleanup Standard («Евроген») и концентрировали. Концентрацию полученных библиотек определяли на QuBit 3 (Invitrogen), к концам кДНК лигировали адаптеры Illumina TruSeq (Illumina, США). Далее секвенировали библиотеки на платформе Illumina HiSeq 2000 (Illumina), парное чтение 150 + 150 нуклеотидов.
Биоинформатическая обработка и анализ данных секвенирования
Демультипликацию данных секвенирования и сборку групп прочтений по молекулярным баркодам проводили с помощью программы MiGEC [12], как описано в работе [11]. Для экстракции CDR3 и сборки Т-клеточных клонотипов использовали программу MiXCR [13]. Качественный анализ клонотипов (V- и J-usage, пересечение репертуаров разных образцов) и оценку разнообразия образцов проводили с помощью пакета программ VDJtools [14].
Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ GraphPad Prism5 (Graph Pad Sofware, США). Анализ публичных клонотипов проводили с помощью алгоритмов R.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цитометрический анализ Т-клеточных популяций в периферической крови
Содержание наивных T-лимфоцитов определяли как в популяции CD3+-клеток периферической крови, так и во фракциях CD4+- и CD8+-лимфоцитов пациентов, страдающих васкулитами и прошедших курс терапии ЦФ в высоких дозах. Популяцию наивных CD3+-лимфоцитов выделяли по фенотипу CD3+CD45RA+CD27+. Полученные данные были сопоставлены с ранее опубликованными нами для когорты здоровых доноров разного возраста [4, 11]. Значимого различия в содержании наивных Т-лимфоцитов у пациентов и здоровых доноров одного возраста обнаружено не было (рис. 2, А).
Анализ разнообразия TCR методом высокопроизводительного секвенирования
Молекулярное баркодирование библиотек кДНК позволило провести коррекцию нуклеотидных замен, произошедших в ходе амплификации и секвенирования библиотек, а для анализа репертуаров TCR пациентов с васкулитами были получены библиотеки кДНК с помощью специфической затравки синтеза и технологии кэп-свитч [4] (рис. 1). Эта технология позволяет равномерно амплифицировать фрагменты, соответствующие различным Т-клеточным рецепторам, не искажая данные о представленности различных вариабельных генных сегментов. Для подготовки библиотеки каждого образца была использована вся тотальная РНК, выделенная в среднем из 3,5 млн мононуклеаров. Вся полученная кДНК использовалась для дальнейшей амплификации. В результате секвенирования было получено более 30 млн прочтений (ридов), минимальное число ридов, соответствующих последовательностям TCR, для образца составило 1,3 х 106, максимальное — 6,5 х 106. Анализ данных секвенирования проводили с учетом молекулярных баркодов, введенных на стадии синтеза кДНК библиотек репертуаров TCR (рис. 1). В данном эксперименте учитывали только те молекулы кДНК, молекулярный баркод которых покрывался хотя бы 3 ридами. В результате для каждого образца было получено от 27 000 до 400 000 групп ридов, несущих уникальные молекулярные баркоды и соответствующих уникальным молекулам кДНК.
Данные секвенирования были нормированы путем экстракции 25 000 случайных молекул кДНК для каждого образца — по наименьшему результату для одного из пациентов. Иными словами, в дальнейшем при анализе учитывали 25 000 уникальных молекул кДНК бета-цепей TCR для каждого образца. Референтная группа была сформирована из данных секвенирования репертуаров TCR когорты здоровых доноров, которые ранее уже были проанализированы аналогичным методом и опубликованы [11]. Данные референтной группы также были проанализированы с нормировкой на 25 000 случайных молекулярных событий на образец. Наш предыдущий экспериментальный опыт показал, что одно событие может быть эквивалентно в среднем одной Т-клетке [15]. Таким образом, разнообразие Т-клеточного репертуара в данном эксперименте оценивали в среднем для 25 000 случайных Т-лимфоцитов периферической крови.
Анализ разнообразия репертуаров бета-цепей TCR проводили с применением таких статистических метрик, как оценка нижней границы разнообразия (индекс Chao1), индекс равномерности распределения (индекс Шеннона–Винера) и наблюдаемое разнообразие CDR3 на 25 000 Т-лимфоцитов.
Мы не выявили значительных изменений в структуре репертуаров TRCs у пациентов с васкулитами относительно результатов здоровых доноров (рис. 2, Б–Г). Однако можно отметить, что, несмотря на то, что доля наивных Т-клеток в периферической крови больных практически не отличалась от таковой у здоровых людей, значения индекса Chao1, рассчитанные для них, лежат по нижней границе (рис. 2, Б, Д), что свидетельствует в пользу снижения разнообразия репертуаров TCR.
Анализ использования вариабельных сегментов бета-цепей
В клинических данных вовлеченность клонального ответа Т-клеток в патогенез болезни зачастую оценивается без использования высокопроизводительного секвенирования — по спектратипам, т. е. распределениям длин участков CDR3 TCR в целом и TCR с конкретными V-сегментами.
Ранее для гранулематоза с полиангиитом (ГПА) [18] и эозинофильного гранулематоза с полиангиитом (ЭГПА) [17] анализ спектратипов TCR показал участие клонального либо олигоклонального ответа Т-клеток, несущих TCR с определенными вариантами V-сегментов. В более поздней работе методом проточной цитофлуометрии было показано значительное увеличение представленности одного или нескольких V-сегментов TCR в периферической крови пациентов с ЭГПА [23].
Эти данные явились предпосылкой для направленного поиска описанных V-сегментов в репертуарах Т-клеток пациентов с ГПА и ЭГПА. Мы проанализировали частоты встречаемости вариантов сегментов бета-цепи в репертуарах TCR пациентов и здоровых доноров и не выявили характерных паттернов экспрессии V- либо J-сегментов TCR, которые бы объединяли репертуары TCR пациентов или здоровых доноров в отдельные различимые кластеры.
Поиск CDR3, ассоциированных с ГПА и ЭГПА
На следующем этапе анализа мы провели поиск аннотированных в литературе последовательностей CDR3, ассоциированных как с ГПА, так и с ЭГПА [17, 18, 23], в данных секвенирования пациентов, включенных в наше исследование. Анализ проводили в клонсетах без количественной нормировки по каждому индивидууму. В результате нам не удалось обнаружить мотивы CDR3, опубликованные ранее как ассоциированные с ГПА либо ЭГПА.
Оценка содержания «публичных» клонотипов в репертуаре TCR
Исследования иммунных репертуаров методами высокопроизводительного секвенирования позволяют получить индивидуальный список вариантов последовательностей TCR, которые организм может использовать в адаптивном иммунном ответе. Прочтение миллионов вариантов TCR в наших исследованиях и работах других коллективов позволило обнаружить варианты TCR, которые формируются независимо в иммунных репертуарах неродственных доноров — неуникальные, или «публичные» варианты TCR [11, 19, 20]. Формирование одинаковых последовательностей TCR у неродственных доноров в процессе случайной сборки связывают с вероятностными процессами сборки TCR при рекомбинации, а также с формированием оптимальных клонов TCR для иммунного ответа на широко распространенные инфекции и с коэволюцией сборки TCR с персистирующими, передающимися в поколениях инфекциями. У родственных доноров обнаруживается больше общих вариантов TCR, чем «публичных» клонотипов у неродственных доноров, и в целом генетическое окружение когорты доноров может влиять на анализ «публичного» репертуара в каждом исследовании TCR.
В предыдущей нашей работе было показано, что доля «публичных» клонотипов в репертуаре TCR снижается с возрастом [4]. Таким образом, этот параметр может служить маркером старения репертуара TCR. Ранее нами был сформирован список клонотипов бета-цепей TCR человека, которые присутствуют в репертуарах Т-лимфоцитов разных доноров. В качестве источника «публичных» клонотипов были выбраны данные секвенирования репертуаров TCR пуповинной крови, характеризующиеся высоким разнообразием TCR и значительной долей «публичных» вариантов TCR в репертуаре. Мы отобрали клонотипы с совпадающей аминокислотной последовательностью участка CDR3, которые встретились как минимум в 4 из 8 образцов репертуаров TCR нормальной пуповинной крови. Этот список был обогащен вариантами коротких CDR3, которые формируются в процессе VDJ-рекомбинации, преимущественно в эмбриогенезе, с повышенной частотой [16] и вариантами, в которых отсутствуют случайные N-инсерции нуклеотидов на стыке сегментов V–D либо D–J генов TCR в результате упрощенной VDJ-рекомбинации в эмбриональном периоде до начала экспрессии TdT-трансферазы.
«Публичные» клонотипы бета-цепей TCR, возникшие в эмбриональный период, частично совпадают со списком «супер-публичных» вариантов TCR, которые могут быть обнаружены у взрослых здоровых доноров (от 8 до 85 лет, n = 68, «суперпубличные» клоны обнаруживаются как минимум в 20 образцах из 68; данные не опубликованы).
Как и при оценке разнообразия репертуаров TCR, в данном анализе использовались клонсеты, нормированные на 25 000 молекул кДНК. Используя список, содержащий 7 200 «публичных» клонотипов, мы провели сравнительный анализ частоты их встречаемости в клонсетах референтной когорты здоровых доноров и пациентов с васкулитами, который показал, что у молодых пациентов достоверно ниже число «публичных» клонотипов (p = 0,04, тест Манна–Уитни, рис. 2, Д) в репертуаре TCR по сравнению со здоровыми людьми того же возраста.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Как уже отмечалось, к настоящему времени не было опубликовано работ по глубокому секвенированию репертуаров TCR пациентов с ГПА и ЭГПА. В одной из работ анализ последовательностей Т-клеточных рецепторов с помощью секвенирования по Сэнгеру выявил у пациентов с ЭГПА общий мотив CDR3 среди высокопредставленных клонотипов Vbeta21 семейства TCR [17]. Также есть данные о доминирующем клонотипе Vbeta8 семейства при ГПА [18].
В настоящей работе нами не были обнаружены специфичные клонотипы или специфичные паттерны экспрессии семейств V- и J-сегментов, которые бы выделяли группу доноров, страдающих ГПА или ЭГПА, по сравнению со здоровыми донорами такого же возраста. Возможно, исследование на значительно большей выборке пациентов позволит установить Т-клеточные клоны, ассоциированные с болезнью. Так, в недавних исследованиях на выборке из 191 донора, страдающего анкилозирующим спондилитом, и 227 здоровых донорах удалось установить консенсусный мотив CDR3 Т-клонов, участвующих в патогенезе этого аутоиммунного заболевания [21]. Также анализ репертуаров TCR, полученных не из периферической крови, а из лимфоцитов, мигрирующих в места воспаления, в совокупности с новыми алгоритмами подсчета вероятности сборки той или иной последовательности CDR3 может привести к успешному решению проблемы идентификации аутоиммунных клонов [22].
Анализ разнообразия репертуаров TCR пациентов с васкулитами показал отсутствие значимых изменений в степени клональности и наблюдаемом разнообразии CDR3 по сравнению с референтной группой. Незначительное изменение в соотношении доли наивных Т-лимфоцитов и индекса границы нижнего разнообразия репертуара может указывать на незначительную клональную экспансию наивных Т-клеток на периферии, которые количественно восстановились до нормального уровня после лечения ЦФ.
Мы показали, что у молодых пациентов достоверно ниже число «публичных» клонотипов по сравнению со здоровыми донорами того же возраста. Такое изменение структуры репертуара TCR молодых пациентов после терапии ЦФ в высоких дозах может являться признаком преждевременного старения Т-клеточного адаптивного иммунитета. Можно утверждать, что заложенный в эмбриональный период набор «публичных» вариантов TCR наивных Т-лимфоцитов существенным образом элиминируется в результате терапии высокими дозами ЦФ. Дальнейшие исследования необходимы для того, чтобы показать, насколько существенны возможные отдаленные последствия таких изменений в структуре Т-клеточного иммунитета.
ВЫВОДЫ
В результате анализа репертуаров Т-клеточных рецепторов, полученных методом глубокого секвенирования, было установлено, что репертуары TCR после лечения циклофосфамидом в высоких дозах восстанавливаются в значительной степени. Вместе с тем количество «публичных» клонотипов у пациентов с аутоиммунными васкулитами снижено по сравнению со здоровыми донорами того же возраста, что свидетельствует о преждевременном старении репертуаров TCR.
В данной работе не было обнаружено клональных изменений TCR, сцепленных с аутоиммуными васкулитами. В полученных массивах данных у пациентов не были найдены аннотированные ранее в литературе Т-клеточные клонотипы.