DOI: 10.24075/vrgmu.2018.022

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Экспериментальные подходы к таргетному редактированию гена CFTR с помощью CRISPR-Cas9

С. А. Смирнихина1, А. А. Анучина1, К. С. Кочергин-Никитский1, Э. П. Адильгереева1, В. Д. Якушина1, А. В. Лавров1,2
Информация об авторах

1 Лаборатория мутагенеза,
Медико-генетический научный центр, Москва

2 Кафедра молекулярной и клеточной генетики, медико-биологический факультет,
Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва

Для корреспонденции: Светлана Анатольевна Смирнихина
ул. Москворечье, д. 1, г. Москва, 115522; moc.liamg@sanihkinrims

Информация о статье

Финансирование: раздел «Редактирование CFTR локуса» поддержан грантом РНФ (Соглашение № 17-75-20095), разделы «Увеличение экспрессии направляющих РНК» и «Увеличение эффективности редактирования CFTR локуса» поддержаны Российской академией наук и государственным заданием ФГБНУ «МГНЦ».

Статья получена: 15.03.2018 Статья принята к печати: 20.03.2018
|

Муковисцидоз — тяжелое аутосомно-рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в гене CFTR, основной из которых в европейской популяции является F508del. Патогенетическая терапия существенно улучшила прогноз для жизни у пациентов с муковисцидозом, однако генная терапия не оказалась такой эффективной, как ожидалось. Геномное редактирование, в том числе с помощью CRISPR-Cas9, открывает новые возможности для этиотропного лечения, так как позволяет исправить мутации в клетках. Целью исследования было сравнение эффективности коррекции мутации F508del с помощью различных комбинаций направляющих РНК и Cas9 и повышение эффективности редактирования. Работу проводили на культуре клеток HEK293T, эффективность редактирования генома оценивали с помощью анализа T7E1, как на геномном, так и на плазмидном сайтах. Наиболее эффективной оказалась комбинация SaCas9 вместе с РНК на мутацию F508del — произошло редактирование 29% аллелей. Комбинация аналогичной направляющей РНК на F508del для SpCas9 показала небольшую эффективность редактирования, что связано с низкой экспрессией направляющей РНК. Были предприняты попытки увеличения экспрессии данной РНК с помощью разных подходов, однако повышения эффективности ее работы получено не было. Стабилизация направляющей РНК путем добавления в последовательность G-квадруплекса, укорочения и добавления GG в 5′-область также не принесла результатов. Вероятно, низкая эффективность работы использованной направляющей РНК обусловлена ее нуклеотидной последовательностью, что ограничивает ее использование.

Ключевые слова: системы CRISPR-Cas, муковисцидоз, CFTR, геномное редактирование, мутация F508del, направляющие РНК, CRISPR-Cas9

КОММЕНТАРИИ (0)