DOI: 10.24075/vrgmu.2018.052

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Эффективность создания делеции CCR5Ddelta32 методом CRISPR-Cas9 в эмбрионах человека

Т. А. Кодылева1, А. О. Кириллова1, Е. А. Тыщик1, В. В. Макаров2, А. В. Хромов2, В. А. Гущин2, А. Н. Абубакиров1, Д. В. Ребриков1,3, Г. Т. Сухих1
Информация об авторах

1 Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени В. И. Кулакова, Москва

2 Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва

3 Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва, Россия

Для корреспонденции: Ребриков Денис Владимирович
ул. Островитянова, д. 1, г. Москва, 117997; moc.liamg@vokirberd

Статья получена: 26.09.2018 Статья принята к печати: 09.10.2018 Опубликовано online: 16.10.2018
|

Быстрое развитие CRISPR-технологий в последние годы значительно расширило сферу их применения и способствовало продвижению в клиническую практику. Редактирование генома CD4+-Т-клеток путем нокаута или модификации гена хемокинового рецептора 5 (CCR5) дало обнадеживающие результаты в лечении ВИЧ-1-инфекции [15].
Однако кроме изменения гена CCR5 в Т-клетках (с целью блокирования развития СПИДа у ВИЧ-инфицированных пациентов), создание CCR5delta32-аллеля может быть использовано как элемент технологии оплодотворения in vitro (IVF) для защиты плода ВИЧ-инфицированных женщин со слабым ответом на антиретровирусную терапию [6, 7].
Введение системы CRISPR-Cas9 на стадии зиготы позволяет модифицировать геном практически во всех клетках организма и это уже продемонстрировано для нескольких наследственных заболеваний [812]. Важно отметить, что измененный геном будет передаваться и последующим поколениям.
Модификация, идентичная природному аллелю CCR5delta32, потенциально защитит плод от ВИЧ-инфекции во время внутриутробного развития, а также во время родов. Дополнительным положительным эффектом может стать пожизненная устойчивость человека к ВИЧ-инфекции.
В этом исследовании мы оптимизировали систему CRISPR-Cas9 с целью создания гомозиготной 32-нуклеотидной делеции (аналогичной природному аллелю CCR5delta32) в S-фазе зиготы человека. Для редактирования генома были использованы зиготы с аномальным числом пронуклеусов, непригодные для программ экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Одобрение этическим комитетом и согласие пациентов

Проведение исследования было одобрено этическим комитетом НМИЦ АГП им. В. И. Кулакова (Москва) (протокол №2017/45). Все этапы исследования (методы) проводились в полном соответствии с существующими международными принципами и правилами работы с эмбрионами. Письменное информированное согласие было получено от каждой семейной пары до момента передачи аномальных зигот для исследования. В исследование были включены семейные пары, в которых для обоих партнёров было показано отсутствие варианта CCR5delta32.

Сбор зигот

Зиготы с аномальным числом пронуклеусов были получены от пациентов, проходящих процедуру ЭКО с сентября 2017 по апрель 2018 годов в НМИЦ АГП им. В.И.Кулакова. От 11 пар была получена 21 аномальная зигота (16 были инъецированы CRISPR-Cas9 и 5 послужили контролем).

Дизайн, синтез и проверка активности гидовых РНК in vitro

Для дизайна гидовых РНК (гРНК) использовали последовательности гена CCR5 дикого типа (WT) и CCR5delta32 из базы данных Национального центра биотехнологической информации (США). Для последующего целевого редактирования и введения желаемой делеции брали участок размером 200 пн, на котором выбирали сайты отжига гРНК с PAM-сайтом (рис. 1). Было подобрано девять гРНК с посадкой в местах, удобных для последующего гомологичного восстановления двухцепочечных разрывов (табл. 1).
Матрицу для транскрипционного синтеза гРНК создавали путем попарного отжига праймеров (Евроген; Россия) с последующей достройкой Taq-полимеразой (Евроген; Россия) в ходе ПЦР. Затем проводили синтез гРНК с использованием Т7 РНК-полимеразы (Сибэнзим; Россия).
Активность полученных гРНК проверяли с помощью тестовой плазмиды, кодирующей последовательность CCR5 дикого типа. Расщепление ДНК in vitro комплексом гРНК и EnGen® Cas9 NLS (New England Biolabs; США) проводили в соответствии со стандартной процедурой, рекомендованной производителем фермента. В качестве наиболее эффективных были выбраны гРНК №1 и №5. Для последующих экспериментов in vivo смесь этих гРНК использовали в соотношении 1:1.

Наработка ДНК-заплатки

Для производства ДНК-заплатки использовали метод стандартной ПЦР с перекрыванием. После сборки конструкции одноцепочечный фрагмент ДНК (хорошо промотирующий переход от негомологичного соединения концов двухцепочечного разрыва (NHEJ) к рекомбинационной репарации) был получен с помощью асимметричной ПЦР с избытком одного из праймеров (с индексом F). Фрагмент имел последовательность: GTGATCACTTGGGTGGTGGCT GTGTTTGCGTCTCTCCCAGGAATCATCTTTACCAGATCTCA AAAAGAAGGTCTTCATTACACCTGCAGCTCTCATTTTCCAT ACATTAAAGATAGTCATCTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGC TTGTCATGGTCATCTGCTACTCGGGAATCCTAA

Формирование РНП-комплекса

Для получения готовых РНП-комплексов и инъекции их в зиготу использовали следующие исходные компоненты: Cas9 (20 мкМ), 1:1 гРНК №1 и №5 (30 нг/мкл), одноцепочечную ДНК (оцДНК) (100 нг/мкл), буфер для разведения (0,25 мМ ЭДТА /10 мМ TrisHCl; pH 7,4).
Для приготовления инъекционного раствора 0,5 мкл Cas9 (20 мкМ) смешивали с 4,5 мкл буфера для разведения. Затем к 5,34 мкл буфера для разведения добавляли 1,56 мкл полученного раствора Cas9 (2 мкМ), 0,6 мкл смеси гРНК (30 нг/мкл) и 2,5 мкл оцДНК (100 нг/ мкл). Смесь инкубировали при 37 °С в течение 10 мин, затем сразу использовали для инъекций.

Инъекция комплекса CRISPR-Cas9 в зиготу

Инъекцию CRISPR-Cas9 в аномальные зиготы проводили в S-фазе клеточного цикла в соответствии со стандартным протоколом Intra Cytoplasmic Sperm Injection (ICSI) [13]. Объем инъекции составлял 1 нл. После инъекции CRISPR-Cas9 зиготы дважды промывали средой Sydney IVF Cleavage Medium (COOK Medical LLC; США), затем перемещали в среду Sydney IVF Blastocyst Medium (COOK Medical LLC; США) и инкубировали в CO2-инкубаторе Эмбриоплан (Вэсттрейд; Россия) со стандартными параметрами в течение 5 дней до образования бластоцисты (около 250 клеток). После инкубации каждую бластоцисту перемещали в 12 мкл буфера для разведения и сразу анализировали с помощью ПЦР.

ПЦР-генотипирование и анализ данных

ПЦР-генотипирование проводили так же, как описано в [14], на приборе DTprime Real-Time (ДНК-Teхнология; Россия), однако для выхода из зоны взаимодействия гРНК использовали другой универсальный праймер CCR5_check2_R: TCATTTCGACACCGAAGCAGA. Результаты ПЦР анализировали с помощью программного обеспечения DTprime v.7.7 (ДНК-Teхнология; Россия).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Из 16 зигот, инъецированных системой CRISPR-Cas9, лишь 8 достигли стадии бластоцисты. Из 5 контрольных зигот (инъецированных буфером для разбавления) 3 достигли бластоцисты. Это стандартная эффективность выхода бластоцист для аномальных зигот, и можно сделать вывод, что процедура инъекции не повысила вероятность остановки развития. ПЦР-генотипирование показало отсутствие исходного варианта WT CCR5 в 5 из 8 бластоцист (с образованием эмбрионов, полностью гомозиготных по CCR5delta32). Два эмбриона продемонстрировали около 3% и один – около 20% остаточного мозаицизма по исходному варианту WT CCR5 (рис. 2). Значения пороговых циклов Cp для каждого эмбриона указаны в табл. 2. Каждый ПЦР-протокол включал в себя отрицательный контрольный образец (буфер для разбавления) в двух повторностях. Все отрицательные контрольные образцы дали отрицательный результат.

ОБСУЖДЕНИЕ

CRISPR-Cas9-опосредованное редактирование генома зигот человека представляет собой эффективный метод модификации внутриклеточной ДНК, достигающий почти 100%-й элиминации исходной последовательности более чем у половины взятых в исследование эмбрионов [9, 10, 12, 15]. Наши результаты хорошо коррелируют с другими случаями применения систем редактирования генома демонстрируя сопоставимо высокую эффективность.
В течение последних двух лет мы видим чрезвычайно быстрое развитие и обновление GE-систем. Однако главным вопросом на сегодняшний день является степень нецелевой активности систем редактирования генома. Только после однозначного подтверждения безопасности такие методы могут быть применены в реальной клинической практике.

ВЫВОДЫ

В работе продемонстрирована эффективность CRISPR-Cas9-опосредованного создания делеции CCR5delta32 в эмбрионах человека. Разработанная система позволила получить более половины полностью модифицированных эмбрионов.

КОММЕНТАРИИ (0)