ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Исследование антимикробной активности полифенолов из древесного сырья

А. Б. Шевелев1, Е. П. Исакова2, Е. В. Трубникова3, Н. Ла Порта4, Ш. Мартенс4, О. А.  Медведева5, Д. В. Трубников6, Р. М. Акбаев7, Ю. К. Бирюкова8, М. В. Зылькова8, А. А. Лебедева1, М. С. Смирнова1, Ю. И. Дерябина2
Информация об авторах

1 Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, Москва, Россия

2 Институт биохимии имени А. Н. Баха, ФИЦ Биотехнологии РАН, Москва

3 Курский государственный университет, Курск

4 Фонд имени Э. Маха, С. Микеле аль Адидже, Италия

5 Курский государственный медицинский университет, Курск

6 Курская государственная сельскохозяйственная академия имени И. И. Иванова, Курск

7 Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — МВА имени К. И. Скрябина, Москва

8 Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М. П. Чумакова РАН, Москва

Для корреспонденции: Алексей Борисович Шевелев
ул. Губкина, д. 3, г. Москва, 119991; moc.liamtoh@a_levehs

Информация о статье

Финансирование: исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации (Соглашения о представлении субсидии № 14.616.21.0083 от 17.07.2017, уникальный идентификатор RFMEFI61617X0083).

Статья получена: 13.06.2018 Статья принята к печати: 20.07.2018 Опубликовано online: 19.09.2018
|

Полифенолы относятся к наиболее массовым продуктам вторичного метаболизма растений. Они находят широкое применение в фармацевтике и парафармацевтике, представляя собой основу для производства большинства средств народной медицины. В настоящее время известно свыше 8000 фенольных соединений растительного происхождения, которые классифицируются на простые фенолы, производные гидроксикоричного и гидроксибензойного спиртов, флавоноиды, стильбены и лигнаны [1]. Флавоноиды — наиболее многочисленный классов полифенольных соединений. Их ключевым элементом является флавоновое ядро: два ароматических кольца, соединенных цепочкой из трех атомов углерода [2]. Флавоноиды (халконы, катехины, антоцианы, лейкоантоцианы, флавоны, флавононы и флавонолы) широко представлены в коре деревьев, цветах, плодах и семенах. Еще одна группа полифенолов — стильбены родственны флавоноидам, так как содержат два бензольных ядра.

Стильбены выполняют функцию противомикробной и антиоксидантной защиты растений от фитопатогенов, озона и ультрафиолетового облучения. Они распространены у самых разных таксономических групп растений, в том числе, у хвойных [3]. Наиболее известным представителем класса стильбенов является ресвератрол. Имеются также публикации об активности птеростильбена, пиносильвина и рапонтицина [2].

В функциональном отношении стильбены и флавоноиды относят к классу фитоалексинов — растительных антибиотиков. Фитоалексины обеспечивают устойчивость растений к инфекционным болезням, синтезируясь в ответ на инфекцию грибов или бактерий. С учетом этого можно ожидать наличие у фитоалексинов бактерицидной активности in vitro. Экстракты растений, богатых флавоноидами, — ромашки, подорожника, зверобоя, календулы, как правило, показывают выраженный антибактериальный эффект [4]. В последние годы интерес к фитоалексинам стимулируется возросшей актуальностью исследований, направленных на борьбу с возникновением лекарственной устойчивости и появлением биопленок. Наиболее важными модельными патогенами с этой точки зрения являются Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans [5]. В качестве перспективных антимикробных средств рассматриваются полифенолы красного вина, ответственные за «французский парадокс»: кверцетин, кэмпферол, ресвератрол и др. [6]. Несмотря на всплеск интереса к проблеме, механизм антибактериальной активности стильбенов и флавоноидов остается неизвестным. При этом все подклассы флавоноидов характеризуются как бактерицидной, так и фунгицидной активностью [7]. Так, ресвератрол подавляет рост возбудителя язвенной болезни желудка Helicobacter pylori in vitro [8], усиливает фагоцитоз патогена C. albicans [9] и подавляет фагоцитоз бактерий (S. aureus и E. coli), причем данный эффект опосредуется рецепторами врожденного иммунитета TLR-2.

Несмотря на большой массив данных о наличии антимикробной активности у растительных полифенолов, их использование в клинической практике до настоящего времени проводится только в форме растительных экстрактов, содержание действующего вещества в которых неизвестно или известно приблизительно. Между тем, рядом компаний, в частности TransMIT Geselschaft fur Technologietransfer mbH (Германия), а также в Иркутском институте химии им. А. Е. Фаворского (Иркутск) налажен выпуск полифенолов из древесины и коры хвойных деревьев в очищенном виде. Применение этих препаратов в качестве наружного средства для лечения гнойново-спалительных заболеваний инфекционной природы могло бы оказаться востребованным, особенно, в связи с распространением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

В рамках работы была поставлена задача охарактеризовать уровень антимикробной активности коммерческих полифенолов из доступного сырья в отношении дерматофитов S. aureus, P. aeruginosa и C. albicans, сопоставив их между собой и с антимикробными препаратами, используемыми для борьбы с этими возбудителями в качестве наружного средства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ресвератрол и дигидромирицетин, очищенные из древесного сырья, были предоставлены для исследования компанией TransMIT Geselschaft fur Technologietransfer mbH (Германия). Дигидрокверцетин был получен из Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского (Иркутск). Аутентичность и чистота препаратов контролировались с помощью метода ЯМР-спектроскопии ядер 1 H на приборе Bruker AM-300 (Bruker Daltonics GmbH; Германия). Ресвератрол представлял собой гомогенный 100%-й транс-изомер.

Вещества растворяли в апирогенном физиологическом растворе инъекционного качества (Эском; Москва) и стерилизовали с использованием шприцевых насадок Sterile Minisart®, содержащих полиэтиленсульфоновые мембраны (Sartorius; Germany). Растворы полифенольных соединений хранили в полипропиленовых пробирках с завинчивающимися крышками объемом 50 мл при +4 °C вне доступа прямого солнечного света в течение 1 месяца.

Мазь Левомеколь (Нижфарм; Нижний Новгород) — наружное средство для лечения гнойных ран, трофических язв, гнойно-воспалительных поражений кожи и ожогов, содержащую диоксиметилтетрагидропиримидин (4,0%) и хлорамфеникол (0,75%), взвешивали в стерильных пробирках Эппендорф и разводили в 96% этаноле в 10 раз.
Мазь Клотримазол (Glaxo-Wellcome Poznan; Польша), содержащую 1% действующего вещества, разводили в 96% этаноле таким же образом, что и мазь Левомеколь.

Штаммы патогенов человека

Патогенные штаммы S. aureus (ATCC 25923), P. aeruginosa (ATCC 27853) и C. albicans (NCTC 2625) были получены из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. Л. А. Тарасевича (Москва). Штаммы культивировали на скошенной агаризованной мясопептонной среде с добавлением 0,1% глюкозы для бактерий и 1% для C. albicans в течение 18–20 ч.

Для получения чашек с индикаторными культурами мясо-пептонный агар объемом 20 мл вносили на стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 9 см. Чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 1 суток и нагревали в суховоздушном термостате до +37 °С.

Приготовленную на мясо-пептонном бульоне 1% агарозу, разливали в стерильные стеклянные пробирки по 2 мл и охлаждали в водяном термостате до 40 °С. В каждую пробирку с расплавленной агарозой вносили по 5×105 КОЕ каждой культуры патогена, размешивали, выливали на чашку с соответствующей питательной средой и равномерно распределяли верхний слой по поверхности.
Через 1 ч после нанесения верхнего слоя индикаторной культуры с помощью стерильного стального пробойника пробивали в агаре лунки диаметром 4 мм.

С использованием в качестве растворителя 96% этанола готовили растворы полифенольных соединений, близкие по концентрации к пределу растворимости: ресвератрол 0,43 М; дигидромирицетин 0,31 М, дигидрокверцетин 0,3 М. Из них, а также из стоковых растворов мазей Левомеколь и Клотримазол в том же растворителе получали разведения в 10, 100 и 1000 раз. Аликвоты каждого из разведений объемом 5 мкл смешивали с 15 мкл стерильной деионизованной воды. 20 мкл полученного раствора вносили в лунки (см. выше). Каждое разведение тестировали в трех повторностях на разных индикаторных чашках. После высыхания внесенных в лунки растворов чашки помещали в термостат при температуре +37 °С и инкубировали в течение 40 ч. Образовавшиеся зоны просветления газона вокруг лунки измеряли штангенциркулем.

Статистическая обработка данных

Определение диаметра зон лизиса проводили с помощью штангенциркуля с точностью до 0,5 мм. Каждое измерение проводили в трех повторностях на разных чашках с индикаторными культурами. Для серии из трех повторностей вычисляли среднеарифметическое значение и среднеквадратичное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты измерений образовавшихся зон просветления газона вокруг лунок с добавленными растворами представлены в таблица.
Антимикробная активность у всех исследованных полифенолов в отношении грамотрицательной бактерии P. aeruginosa и C. albicans отсутствует даже при максимально возможных концентрациях 21,5, 15,5 и 15,0 мМ соответственно. Напротив, в отношении грамположительной бактерии S. aureus все три соединения показывают активность вплоть до минимальной концентрации 0,22, 0,15 и 0,15 мМ соответственно. In vitro активность дигидромирицетина в отношении S. aureus немного выше, чем у ресвератрола и дигидрокверцетина.

При этом минимальной действующей концентрацией Левомеколя в отношении S. aureus оказалась 24,2 мМ, а в отношении P. aeruginosa — 242,3 мМ. Минимальная действующая концентрация Клотримазола в отношении C. albicans оказалась ниже 3,4 мМ.

ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе имеется ряд исследований антимикробной (антибактериальной и антифунгальной) активности ресвератрола и других полифенолов in vitro [1012]. Например, сообщается о тестировании такой активности в отношении дерматофитов человека [13]. В работе [14] показано, что ресвератрол вызывает подавление фагоцитоза бактерий, воздействуя на макрофаги через рецептор TLR2 и ядерный фактор NF-κβ. Имеются также данные о том, что ресвератрол способен подавлять воспаление сетчатки глаза, индуцированное экспериментальным инфицированием S. аureus [15]. Однако до настоящего времени полифенолы нигде не применяются в качестве субстанции, представляющей собой альтернативу антибиотикам, что оставляет открытым вопрос о необходимости продолжения испытаний с целью получения исчерпывающей характеристики их специфической фармакологической активности.

Проведенные нами исследования показали, что молярная антимикробная активность полифенолов как флавонольной (дигидромирицетин и дигидрокверцетин), так и стильбеновой природы (ресвератрол) в отношении грамположительного патогена человека S. aureus находится на высоком уровне и превышает молярную активность некоторых антибиотиков, традиционно применяемых в качестве наружного средства борьбы с ним.

Напротив, активность полифенолов в отношении грамотрицательного патогена P. aeruginosa и дрожжеподобного гриба C. albicans оказалась столь низкой, что не детектировалась в использованной тест-системе. Это наблюдение не вполне соответствует опубликованным данным [13], где сообщается о наличии у ресвератрола выраженной активности против дерматофитных микроорганизмов S. aureus и P. aeruginosa (в диапазоне 171–342 мкг/мл, т. е. 39–78 мМ) и микроскопических грибов Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum и Microsporum gypseum (25–50 мкг/мл, т. е. 5,7–11,4 мМ).

Полученные данные свидетельствуют о высокой перспективности использования растительных полифенолов, прежде всего, дигидромирицетина, в качестве наружного средства для лечения заболеваний кожи, вызванных стафилококковой инфекцией, включая штаммы с лекарственной устойчивостью. Однако для этого требуются предварительные эксперименты по исследованию антимикробной активности полифенолов на животных моделях. Такие работы необходимы для оценки возможной побочной токсичности этих соединений для клеток животных, а также для оценки их иммуностимулирующих или иммуносупрессорных свойств [14, 15].

ВЫВОДЫ

Выполненное исследование подтверждает наличие у ресвератрола, дигидромирицетина и дигидрокверцетина выраженной антимикробной активности in vitro при концентрации 0,15 мМ и выше. Наиболее эффективным оказался дигидромирицетин. Эти результаты показывают значительно большую удельную бактерицидную активность полифенолов по сравнению с традиционным антибактериальным препаратом Левомеколем, минимальная действующая концентрация которого в отношении S. aureus составляет 24,2 мМ.

КОММЕНТАРИИ (0)