Полифенолы относятся к наиболее массовым продуктам вторичного метаболизма растений. Они находят широкое применение в фармацевтике и парафармацевтике, представляя собой основу для производства большинства средств народной медицины. В настоящее время известно свыше 8000 фенольных соединений растительного происхождения, которые классифицируются на простые фенолы, производные гидроксикоричного и гидроксибензойного спиртов, флавоноиды, стильбены и лигнаны [1]. Флавоноиды — наиболее многочисленный классов полифенольных соединений. Их ключевым элементом является флавоновое ядро: два ароматических кольца, соединенных цепочкой из трех атомов углерода [2]. Флавоноиды (халконы, катехины, антоцианы, лейкоантоцианы, флавоны, флавононы и флавонолы) широко представлены в коре деревьев, цветах, плодах и семенах. Еще одна группа полифенолов — стильбены родственны флавоноидам, так как содержат два бензольных ядра.

Стильбены выполняют функцию противомикробной и антиоксидантной защиты растений от фитопатогенов, озона и ультрафиолетового облучения. Они распространены у самых разных таксономических групп растений, в том числе, у хвойных [3]. Наиболее известным представителем класса стильбенов является ресвератрол. Имеются также публикации об активности птеростильбена, пиносильвина и рапонтицина [2].

В функциональном отношении стильбены и флавоноиды относят к классу фитоалексинов — растительных антибиотиков. Фитоалексины обеспечивают устойчивость растений к инфекционным болезням, синтезируясь в ответ на инфекцию грибов или бактерий. С учетом этого можно ожидать наличие у фитоалексинов бактерицидной активности in vitro. Экстракты растений, богатых флавоноидами, — ромашки, подорожника, зверобоя, календулы, как правило, показывают выраженный антибактериальный эффект [4]. В последние годы интерес к фитоалексинам стимулируется возросшей актуальностью исследований, направленных на борьбу с возникновением лекарственной устойчивости и появлением биопленок. Наиболее важными модельными патогенами с этой точки зрения являются Mycobacterium tuberculosis, Streptococcus pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus mutans [5]. В качестве перспективных антимикробных средств рассматриваются полифенолы красного вина, ответственные за «французский парадокс»: кверцетин, кэмпферол, ресвератрол и др. [6]. Несмотря на всплеск интереса к проблеме, механизм антибактериальной активности стильбенов и флавоноидов остается неизвестным. При этом все подклассы флавоноидов характеризуются как бактерицидной, так и фунгицидной активностью [7]. Так, ресвератрол подавляет рост возбудителя язвенной болезни желудка Helicobacter pylori in vitro [8], усиливает фагоцитоз патогена C. albicans [9] и подавляет фагоцитоз бактерий (S. aureus и E. coli), причем данный эффект опосредуется рецепторами врожденного иммунитета TLR-2.

Несмотря на большой массив данных о наличии антимикробной активности у растительных полифенолов, их использование в клинической практике до настоящего времени проводится только в форме растительных экстрактов, содержание действующего вещества в которых неизвестно или известно приблизительно. Между тем, рядом компаний, в частности TransMIT Geselschaft fur Technologietransfer mbH (Германия), а также в Иркутском институте химии им. А. Е. Фаворского (Иркутск) налажен выпуск полифенолов из древесины и коры хвойных деревьев в очищенном виде. Применение этих препаратов в качестве наружного средства для лечения гнойново-спалительных заболеваний инфекционной природы могло бы оказаться востребованным, особенно, в связи с распространением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью.

В рамках работы была поставлена задача охарактеризовать уровень антимикробной активности коммерческих полифенолов из доступного сырья в отношении дерматофитов S. aureus, P. aeruginosa и C. albicans, сопоставив их между собой и с антимикробными препаратами, используемыми для борьбы с этими возбудителями в качестве наружного средства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Ресвератрол и дигидромирицетин, очищенные из древесного сырья, были предоставлены для исследования компанией TransMIT Geselschaft fur Technologietransfer mbH (Германия). Дигидрокверцетин был получен из Иркутского института химии им. А. Е. Фаворского (Иркутск). Аутентичность и чистота препаратов контролировались с помощью метода ЯМР-спектроскопии ядер 1 H на приборе Bruker AM-300 (Bruker Daltonics GmbH; Германия). Ресвератрол представлял собой гомогенный 100%-й транс-изомер.

Вещества растворяли в апирогенном физиологическом растворе инъекционного качества (Эском; Москва) и стерилизовали с использованием шприцевых насадок Sterile Minisart®, содержащих полиэтиленсульфоновые мембраны (Sartorius; Germany). Растворы полифенольных соединений хранили в полипропиленовых пробирках с завинчивающимися крышками объемом 50 мл при +4 °C вне доступа прямого солнечного света в течение 1 месяца.

Мазь Левомеколь (Нижфарм; Нижний Новгород) — наружное средство для лечения гнойных ран, трофических язв, гнойно-воспалительных поражений кожи и ожогов, содержащую диоксиметилтетрагидропиримидин (4,0%) и хлорамфеникол (0,75%), взвешивали в стерильных пробирках Эппендорф и разводили в 96% этаноле в 10 раз.
Мазь Клотримазол (Glaxo-Wellcome Poznan; Польша), содержащую 1% действующего вещества, разводили в 96% этаноле таким же образом, что и мазь Левомеколь.

Штаммы патогенов человека

Патогенные штаммы S. aureus (ATCC 25923), P. aeruginosa (ATCC 27853) и C. albicans (NCTC 2625) были получены из коллекции Государственного института стандартизации и контроля им. Л. А. Тарасевича (Москва). Штаммы культивировали на скошенной агаризованной мясопептонной среде с добавлением 0,1% глюкозы для бактерий и 1% для C. albicans в течение 18–20 ч.

Для получения чашек с индикаторными культурами мясо-пептонный агар объемом 20 мл вносили на стерильные пластиковые чашки Петри диаметром 9 см. Чашки подсушивали при комнатной температуре в течение 1 суток и нагревали в суховоздушном термостате до +37 °С.

Приготовленную на мясо-пептонном бульоне 1% агарозу, разливали в стерильные стеклянные пробирки по 2 мл и охлаждали в водяном термостате до 40 °С. В каждую пробирку с расплавленной агарозой вносили по 5×10⁵ КОЕ каждой культуры патогена, размешивали, выливали на чашку с соответствующей питательной средой и равномерно распределяли верхний слой по поверхности.
Через 1 ч после нанесения верхнего слоя индикаторной культуры с помощью стерильного стального пробойника пробивали в агаре лунки диаметром 4 мм.

С использованием в качестве растворителя 96% этанола готовили растворы полифенольных соединений, близкие по концентрации к пределу растворимости: ресвератрол 0,43 М; дигидромирицетин 0,31 М, дигидрокверцетин 0,3 М. Из них, а также из стоковых растворов мазей Левомеколь и Клотримазол в том же растворителе получали разведения в 10, 100 и 1000 раз. Аликвоты каждого из разведений объемом 5 мкл смешивали с 15 мкл стерильной деионизованной воды. 20 мкл полученного раствора вносили в лунки (см. выше). Каждое разведение тестировали в трех повторностях на разных индикаторных чашках. После высыхания внесенных в лунки растворов чашки помещали в термостат при температуре +37 °С и инкубировали в течение 40 ч. Образовавшиеся зоны просветления газона вокруг лунки измеряли штангенциркулем.

Статистическая обработка данных

Определение диаметра зон лизиса проводили с помощью штангенциркуля с точностью до 0,5 мм. Каждое измерение проводили в трех повторностях на разных чашках с индикаторными культурами. Для серии из трех повторностей вычисляли среднеарифметическое значение и среднеквадратичное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты измерений образовавшихся зон просветления газона вокруг лунок с добавленными растворами представлены в таблица.
Антимикробная активность у всех исследованных полифенолов в отношении грамотрицательной бактерии P. aeruginosa и C. albicans отсутствует даже при максимально возможных концентрациях 21,5, 15,5 и 15,0 мМ соответственно. Напротив, в отношении грамположительной бактерии S. aureus все три соединения показывают активность вплоть до минимальной концентрации 0,22, 0,15 и 0,15 мМ соответственно. In vitro активность дигидромирицетина в отношении S. aureus немного выше, чем у ресвератрола и дигидрокверцетина.

При этом минимальной действующей концентрацией Левомеколя в отношении S. aureus оказалась 24,2 мМ, а в отношении P. aeruginosa — 242,3 мМ. Минимальная действующая концентрация Клотримазола в отношении C. albicans оказалась ниже 3,4 мМ.

ОБСУЖДЕНИЕ

В литературе имеется ряд исследований антимикробной (антибактериальной и антифунгальной) активности ресвератрола и других полифенолов in vitro [10–12]. Например, сообщается о тестировании такой активности в отношении дерматофитов человека [13]. В работе [14] показано, что ресвератрол вызывает подавление фагоцитоза бактерий, воздействуя на макрофаги через рецептор TLR2 и ядерный фактор NF-κβ. Имеются также данные о том, что ресвератрол способен подавлять воспаление сетчатки глаза, индуцированное экспериментальным инфицированием S. аureus [15]. Однако до настоящего времени полифенолы нигде не применяются в качестве субстанции, представляющей собой альтернативу антибиотикам, что оставляет открытым вопрос о необходимости продолжения испытаний с целью получения исчерпывающей характеристики их специфической фармакологической активности.

Проведенные нами исследования показали, что молярная антимикробная активность полифенолов как флавонольной (дигидромирицетин и дигидрокверцетин), так и стильбеновой природы (ресвератрол) в отношении грамположительного патогена человека S. aureus находится на высоком уровне и превышает молярную активность некоторых антибиотиков, традиционно применяемых в качестве наружного средства борьбы с ним.

Напротив, активность полифенолов в отношении грамотрицательного патогена P. aeruginosa и дрожжеподобного гриба C. albicans оказалась столь низкой, что не детектировалась в использованной тест-системе. Это наблюдение не вполне соответствует опубликованным данным [13], где сообщается о наличии у ресвератрола выраженной активности против дерматофитных микроорганизмов S. aureus и P. aeruginosa (в диапазоне 171–342 мкг/мл, т. е. 39–78 мМ) и микроскопических грибов Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton tonsurans, Trichophyton rubrum, Epidermophyton floccosum и Microsporum gypseum (25–50 мкг/мл, т. е. 5,7–11,4 мМ).

Полученные данные свидетельствуют о высокой перспективности использования растительных полифенолов, прежде всего, дигидромирицетина, в качестве наружного средства для лечения заболеваний кожи, вызванных стафилококковой инфекцией, включая штаммы с лекарственной устойчивостью. Однако для этого требуются предварительные эксперименты по исследованию антимикробной активности полифенолов на животных моделях. Такие работы необходимы для оценки возможной побочной токсичности этих соединений для клеток животных, а также для оценки их иммуностимулирующих или иммуносупрессорных свойств [14, 15].

ВЫВОДЫ

Выполненное исследование подтверждает наличие у ресвератрола, дигидромирицетина и дигидрокверцетина выраженной антимикробной активности in vitro при концентрации 0,15 мМ и выше. Наиболее эффективным оказался дигидромирицетин. Эти результаты показывают значительно большую удельную бактерицидную активность полифенолов по сравнению с традиционным антибактериальным препаратом Левомеколем, минимальная действующая концентрация которого в отношении S. aureus составляет 24,2 мМ.