Среди наследственных нарушений липидного обмена семейная гиперхолестеринемия (СГХС) служит одной из наиболее известных причин ранней манифестации ишемической болезни сердца (ИБС) и ведет к двадцатикратному повышению риска развития сердечно- сосудистых заболеваний [1]. Это самое распространенное моногенное нарушение липидного обмена с аутосомно- доминантным типом наследования, ведущее к повышению уровня холестерина липопротеидов низкой плотности (ЛНП). Большинство (60–80%) больных гетерозиготной формой СГХС, определенной клинически, являются носителями мутаций в гене рецептора ЛНП (LDLR); в разных географических регионах преобладают различные мутации. В результате происходит уменьшение количества молекул рецептора ЛНП (ЛНПР) или снижение активности ЛНПР. Ген LDLR расположен в коротком плече 19 хромосомы и состоит из 18 экзонов, транскрипция и трансляция которых приводит к синтезу 5 доменов, формирующих на поверхности клетки ЛНПР [2]. Около 5–10% больных гетерозиготной формой СГХС являются носителями мутаций гена APOB, что проявляется фенотипически менее выраженным повышением уровня холестерина, чем в случае мутаций LDLR, и эти мутации более распространены у жителей центральной Европы, чем в других регионах [3]. Дефект белка апоB100 на частицах ЛНП препятствует их связыванию с ЛНПР. Ген картирован на хромосоме 2p и включает 29 экзонов [2]. Мутации приобретения функции (gain-of-function, GOF) гена пропротеиновой конвертазы субтилизин-кексинового типа 9 (PCSK9) представляют собой третью основную причину развития аутосомно-доминантной СГХС, обусловливая менее 1% случаев СГХС в большинстве исследованных популяций. Они приводят к ускоренной интернализации и разрушению ЛНПР и уменьшению количества молекул ЛНПР. Ген PCSK9 расположен в малом плече хромосомы 1p32 и содержит 12 экзонов и 11 интронов [4, 5]. Очень редко причиной развития СГХС являются мутации в других генах, участвующих в обмене липидов [3]. Нередко пациенты оказываются носителями двух мутаций в генах, ассоциированных с СГХС. Однако у 20–40% больных с клинически диагностированной СГХС причинную мутацию выявить не удается.
Целью работы было определение спектра патологических вариантов генов системы липидного обмена у больных острым коронарным синдромом (ОКС) с клинически диагностированной СГХС с помощью таргетного секвенирования.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы данные больных, отобранных из 2081 участника двух многоцентровых (4 центра в трех городах — Москва, Казань, Ставрополь) наблюдательных исследований больных с ОКС, включение в которые проходило с 2004 по 2007 и с 2014 по 2016 годы. Протокол исследования подробно описан ранее [6]. Проведение исследования одобрено решением заседания Этического комитета ФГБУ «Учебно-научный медицинский центр» Управления делами Президента РФ (протокол № 14/14 от 20.10.2014).

Для данной работы из первого периода набора отобрано 326 больных, из второго 374. В течение первого периода набора критериями включения пациентов были: «раннее» развитие ОКС (в возрасте ≤ 55 лет у мужчин и ≤ 60 лет у женщин); развитие ОКС не ранее 10 дней до индексной госпитализации; наличие СГХС, диагностированной по критериям Голландской сети липидных клиник КГСЛК и регистра Simon Broome [7, 8]; наличие подписанного информированного согласия на участие в исследовании. Критерии включения во время второго периода: те же плюс необходимость проведения чрескожного коронарного вмешательства (ЧКВ) вне зависимости от итогового решения о его проведении у пациентов с ОКС.

СГХС диагностировали по критериям Голландской сети липидных клиник (КГСЛК) и регистра Simon Broome. По КГСЛК учитывается отягощенная наследственность, раннее развитие ИБС у самого больного, данные осмотра (сухожильные ксантомы, липоидная дуга роговицы), а также уровень ЛНП. При оценке данных, если больной набирает больше 8 баллов, речь идет об определенной СГХС, 6–8 баллов говорят о вероятной СГХС, 3–5 баллов свидетельствуют о возможной СГХС, а менее 3 баллов — диагноз СГХС маловероятен [7]. Согласно критериям регистра Simon Broome, выявление СГХС основывается на индивидуальной оценке уровня общего холестерина и ЛНП в зависимости от возраста больного и степени родства с тем, у кого этот уровень также повышен. В клинической практике согласно данным критериям возможна диагностика лишь возможной СГХС, так как диагноз определенной СГХС требует выявления причинной мутации [8].

Для проведения молекулярно-генетического исследования были отобраны 38 пациентов по следующему алгоритму. Первая часть исследования: все пациенты, набравшие ≥ 5 баллов по КГСЛК, и все набравшие 4 балла по КГСЛК + пациенты с СГХС, диагностированной по регистру Simon Broome (всего 10 человек). Вторая часть исследования: все набравшие ≥ 5 баллов по КГСЛК + пациенты с СГХС, диагностированной по регистру Simon Broome, и с отягощенной наследственностью (всего 24 человека). Из второй части исследования в анализ были также включены 4 пациента, которые в индексную госпитализацию не подходили под критерий наличия «раннего» ОКС, однако у которых был известен факт ранней манифестации ИБС (≥ 6 баллов по КГСЛК и 5 баллов по КГСЛК + отягощенная наследственность).

Молекулярно-генетическое исследование проводили в генетической лаборатории ООО «Ридсенс» (Москва). Выделение ДНК выполняли посредством наборов для выделения геномной ДНК из крови на спин-колонках К-Сорб (Синтол; Россия). Синтез ДНК-библиотек из ДНК образцов для последующего секвенирования на секвенаторе нового поколения Illumina MiSeq (Illumina, США) производили с использованием набора NEB Next Ultra (NEB; США). Обогащение целевыми фрагментами генов (кодирующими областями) с использованием методики селективного захвата участков ДНК с помощью синтезированных зондов проводили с использованием таргетной синтетической панели обогащения NimbleGen (Roche; США). Проверку качества амплифицированной обогащенной ДНК-библиотеки выполняли провометодом капиллярного гель-электрофореза с использованием прибора BioAnalyzer 2100 (Roche; Швейцария). Контроль качества амплифицированной обогащенной ДНК- библиотеки производили с использованием ДНК- флуориметра Qubit (Invitrogen; США) и капиллярного электрофореза BioAnalizer (Agilent; США). Далее проводили запуск секвенатора Illumina MiSeq в соответствии с рекомендациями производителя с использованием набора реактивов на 300 циклов (MiSeq 300 cycles v2).

Сначала во всех исследуемых образцах проводили исследование 3 генов, ассоциированных с СГХС: LDLR, APOB, PCSK9. Затем при отсутствии значимых генетических изменений панель расширяли с исследованием следующих генов, ассоциированных с обменом липидов: APOA1, APOA5, APOC2, APOE, APOC3, ABCA1, ABCG1, ABCG5, ABCG8, ANGPTL3, CEL, CH25H, CPT2, CYP2D6, CYP3A4, CYP3A5, GPD1, GPIHBP1, INSIG2, LCAT, LDLRAP1, LIPA, LMF1, LPA, LPL, MTTP, NPC1L1, PNPLA2, PPARA, SAR1B.
Проверка качества панели зондов включала следующие стадии для каждого из образцов: картирование прочтений секвенирования на референсный геном человека (сборка GRCh37.p13 hg19), расчет эффективности покрытия на основе данных о целевых фрагментах (для анализа брали нуклеотиды с минимальным покрытием 20х), используемых для синтеза зондов, поиск целевых мутаций в рамках панели обогащения, аннотацию найденных мутаций с помощью баз данных (HGMD, COSMIC, ClinVar, 1000 GenomesProject, dbSNP, ExAC), оценку консервативности замен с помощью методов моделирования (POLYPHEN, SIFT, MUTATION TASTER, FATHMM, CADD, DANN, EIGEN). Аннотацию вариаций проводили в соответствии с рекомендациями ACMG [9].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Все пациенты с выявленными изменениями гетерозиготны. По результатам проведенного обследования мутации в трех «классических» генах, ответственных за развитие СГХС, были выявлены у 11 пациентов.
Среди них три патогенных и вероятно патогенных варианта в гене LDLR, а также один с неуточненной клинической значимостью. Патогенная мутация p.Val273_ Cys313del ранее не описана и приводит к делеции внутри рамки считывания в области 6 экзона, в результате чего в ЛНПР отсутствует домен класса А7 в N-концевом участке [10]. Данная мутация относится к 3 классу мутаций гена LDLR, ведущих к синтезу рецептора с нарушением его связывания с ЛНП. Мутация g.11218068_11218190del, с той же аминокислотной заменой описана Usifo и соавторами [11]. Ранее не была описана мутация неуточненной клинической значимости p.Ala776Ser, расположенная в 16 экзоне. Редкие миссенс варианты данной локализации распространены в общей популяции и большинство из них классифицируются как непатогенные, однако полностью исключить фенотип гиперхолестеринемии не представляется возможным [12]. Вероятно патогенная мутация p.Gly20Arg гена LDLR встречалась у двух пациентов. Патогенный вариант p.Glu208Lys описан у одного больного.
В гене APOB выявлены патогенные и вероятно патогенные мутации у двоих пациентов и еще у двоих обнаружены мутации неуточненной клинической значимости. Встречаемость всех определенных вариантов в общей популяции составляет менее 1%.
В гене PCSK9 обнаружены ранее не описанные мутации неуточненной клинической значимости у двоих обследованных. Мутация p.Glu612Lys расположена в 11 экзоне. Известно о связи мутаций в этом функциональном домене (цистеин-гистидин-обогащенный С-концевой домен) с СГХС. В частности, имеется модифицирующее влияние подобных генетических вариантов на пациентов, являющимися носителями мутаций в гене LDLR (важно отметить, что обследованный нами больной также является носителем вероятно патогенной мутации p.Gly20Arg гена LDLR) [13]. Мутация c.*415G>A расположена в 12 экзоне. Это нетранслируемый участок, который содержит элементы, отвечающие за экспрессию гена. Однако оценить функциональные последствия такого рода генетических изменений не представляется возможным.

У пациентов с клинически диагностированной СГХС встречались мутации и в других генах, участвующих в липидном обмене. Наиболее широко представлены изменения в гене APOE; в нем были выявлены мутации у двоих пациентов. В частности, у одного из них имелась вероятно патогенная ранее не описанная мутация p.Arg160His с локализацией в 4 экзоне. Этот участок отвечает за связывание липопротеина APOE с ЛНПР и уже известно об ассоциации вариантов данной локализации (с аналогичной аминокислотной заменой) с развитием аутосомно доминантной семейной дисбеталипротеинемии [14]. Кроме того, у четверых пациентов имелся один и тот же полиморфизм гена APOE, отвечающий за образование атерогенной изоформы ε4 аполипопротеина Е (в одном из случаев одновременно с носительством мутации гена APOB неуточненной клинической значимости p.Ala4002Val).

У троих пациентов были обнаружены мутации в гене ABCA1, из них одна патогенная и две вероятно патогенные, обусловливающие сниженный уровень ЛВП. У двоих обследованных имелись мутации в гене ABCG8: патогенная и неуточненной клинической значимости, для которых описана связь с ситостеролемией [15]. Один больной имел вероятно патогенную мутацию в гене ABCG5, один — вероятно патогенную мутацию гена LPL, еще у одного была патогенная мутация в гене ANGPTL3 и у одного — мутация неуточненной клинической значимости в гене MTTP.
Таким образом, из 38 пациентов с клинически диагностированной СГХС у 24 (63,2%) были выявлены генетические изменения, которые могли бы обусловить клинические проявления СГХС и раннюю манифестацию ИБС. Среди них 5 ранее описаны не были.
Результаты проведенного обследования представлены в таблица и на рисунок.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Частота встречаемости СГХС в общей популяции составляет 0,2–0,5%, а среди пациентов с ОКС может достигать 8%, в связи с чем ее адекватная диагностика именно в этой группе пациентов на сегодняшний день представляется актуальной проблемой, так как дает возможность своевременного назначения соответствующей липидснижающей терапии и проведения каскадного скрининга [16, 17]. Изучение распространенности различных мутаций, вызывающих развитие СГХС, в российской популяции находится только на начальном этапе [18]. Однако известно о крайней гетерогенности и отсутствии эффекта основателя, что было выявлено исследователями из Санкт-Петербурга [19]. В частности, в обследованной ими группе больных с СГХС (без ОКС) не было обнаружено носителей мутации гена APOB. Еще в одном из исследований, проведенном также на Северо-Западе России, не выявлено мутаций в гене APOB [20]. В нашей выборке больных с «ранним» развитием ОКС мутации в генах LDLR и APOB представлены почти в одинаковой степени (четыре мутации гена LDLR, из которых три патогенных/вероятно патогенных, а одна встречается у двух пациентов; четыре мутации APOB, из которых две патогенных/вероятно патогенных). Обращает также на себя внимание выявление в обследованной нами группе двух больных с фенотипом СГХС, которые являются носителями мутаций c неизвестной клинической значимостью в гене PCSK9. На сегодняшний день в России описание случаев мутаций PCSK9 пока единичны [21]. Все известные патологические варианты гена PCSK9 являются чрезвычайно редкими и имеют аллельную частоту менее 0,1% в общей популяции [22]. Распределение в общей популяции однонуклеотидных полиморфизмов, мало влияющих на обмен холестерина, такое, что у большинства наблюдается баланс между аллелями, повышающими и снижающими уровень ЛНП. У людей же, находящихся в крайних точках этого распределения, имеется наследственно обусловленное преобладание аллелей, повышающих уровень ЛНП, которые кумулятивно могут приводить к достижению значений ЛНП, характерных для гетерозиготной СГХС. Одним из самых характерных и изученных примеров такого полиморфизма является полиморфизм гена APOE ε2/ε3/e4, когда у носителей ε4 риск ИБС в несколько раз выше [23, 24]. Известно об ассоциации носительства генотипа изоформ ε4 полиморфного маркера p.Cys130Arg с развитием СГХС в популяции России [25], что подтверждается и нашими данными, где этот полиморфизм обнаружен у четверых больных. Важно также обратить внимание на широкую представленность редких мутаций в других генах липидного обмена (APOE, ABCA1, ABCG5, ABCG8, LPL, ANGPTL3, MTTP), что может указывать на возможно иную распространенность мутаций в популяции больных с «ранним» развитием ОКС и СГХС в России. Среди обследованных у пациентки №1 (см. таблица) ранее не описанная мутация p.Val273_Cys313del в гене LDLR носила определенно патогенный характер [11]. Был проведен каскадный скрининг у дочери пробанда (известно о повышении у нее уровня общего холестерина), не выявивший носительства патологического варианта гена. Итак, из 38 обследованных у 14 пациентов (36,8%) выявленные генетические варианты носили патогенный и вероятно патогенный характер, а у 10 (26,3%) имели неуточненную клиническую значимость. Данные о частоте встречаемости генетических вариантов, связанных с СГХС именно у больных с «ранним» ОКС в литературе не описаны, однако согласно исследованию ряда авторов, проводивших таргетное секвенирование у 104 пациентов с клинически диагностированной СГХС, были выявлены патологические варианты как в генах LDLR, APOB, PCSK9, так и в редких генах системы липидного обмена у 67% обследованных с определенной СГХС [26].

ВЫВОДЫ

Использование клинических критериев позволяет с помощью последующего таргетного секвенирования выявить среди пациентов с ОКС и СГХС носителей патологических генетических вариантов не только в «классических» генах, связанных с СГХС, но и в редких, которые, возможно, ассоциированы с фенотипическим проявлениями СГХС.