DOI: 10.24075/vrgmu.2018.063

МНЕНИЕ

Биолюминесцентный имиджинг: новые возможности

Информация об авторах

1 Отдел биомолекулярной химии, Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Москва

2 Лаборатория химии природных соединений, Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н. И. Пирогова, Москва

Для корреспонденции: Александр Сергеевич Щеглов
ул. Миклухо-Маклая, 16/10, г. Москва, 117997; ur.liam@trakuj

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства высшего образования и науки РФ в рамках реализации федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014–2020 годы», Соглашение № 14.613.21.0062, идентификатор проекта RFMEFI61317X0062.

Статья получена: 02.11.2018 Статья принята к печати: 19.11.2018 Опубликовано online: 04.12.2018
|

Современные исследования молекулярных событий при изучении развития заболеваний не обходятся без биоимиджинга тканей и целых организмов [1]. В биоимиджинге очень популярно применение флуоресцентных и биолюминесцентных белков (люцифераз). Для флуоресцентного биоимиджинга разработан набор флуоресцентных белков с различными спектральными свойствами — от фиолетовых до дальне-красных, фотоактивируемые и фотопереключаемые белки, а также сенсоры на их основе [2]. Доступных для биоимиджинга люцифераз существенно меньше, чем флуоресцентных белков, однако методы, созданные на основе биолюминесценции, относятся к самым чувствительным для проведения исследований в глубоких тканях. Люцифераза катализирует свечение в результате реакции окисления молекулярного субстрата люциферина, поэтому для получения аналитического сигнала, в отличие от флуоресцентного белка, внешний источник излучения не требуется. В связи с этим биолюминесцентный имиджинг in vivo фактически не имеет фоновых помех и обладает беспрецедентной чувствительностью [3]. Однако использование люцифераз в качестве репортерных белков не лишено недостатков. Так, активность некоторых из них сильно зависит от количества кофакторов либо ингибируется внутриклеточными компонентами или лекарственными препаратами [4]. И несмотря на то что применение биолюминесцентых систем менее удобно в практическом смысле, так как для световой эмиссии необходимо как минимум два компонента, а не один, эта область продолжает бурно развиваться.

Инструменты для биолюминесцентного имиджинга

Многоцветный биоимиджинг находит свое применение в случае необходимости одновременного наблюдения разных событий на молекулярном уровне (например, экспрессии генов или белок–белковых взаимодействий), позволяя сократить количество используемых в эксперименте животных. При этом возможны разные стратегии. Вот некоторые из них: совместное использование люцифераз разных организмов, мутантных люцифераз одного организма, применение гибридных белковых конструкций «люцифераза-флуоресцентный белок» и др. [5]. Среди наиболее популярных люцифераз для биоимиджинга — люциферазы Fluc североамериканского светляка Photinus pyralis (62 кДа), жука-щелкуна Pyrophorus plagiophthalamus (62 кДа) (λmax ≈ 540–615 нм) и люциферазы морских организмов Renilla reniformis Rluc (36 кДа) и Gaussia princeps Gluc (20 кДа) (λmax ≈ 480 нм) [6]. Люциферазы почвенных организмов катализируют реакцию D-люциферина с кислородом в присутствии кофакторов АТФ и ионов Mg2+, морские люциферазы работают совместно с люциферином целентеразином. С 2012 г. уникальную популярность приобрела инженерная люцифераза NanoLuc (19 кДа) (λmax = 460 нм), разработанная на основе малого домена люциферазы Oplophorus gracilirostris [7]. Для NanoLuc используется другой субстрат — синтетический аналог целентеразина фуримазин.

Популярность люцифераз, работающих с D-люциферином, обусловлена не только исторически, но и по причине того, что данная система пригодна для имиджинга процессов, в которых участвует молекула АТФ [8]. Кроме того, для D-люциферина было разработано широкое разнообразие структурных аналогов [3], в том числе испускающих свет в более красной области спектра, например недавно предложенный AkaLumine-HCl (λmax = 677нм) [9]. Здесь необходимо пояснить, что смещение спектра излучения биолюминесценции в сторону ближней ИКобласти значимо, поскольку эта область является окном прозрачности для изучения процессов в глубоких тканях in vivo. Помимо улучшенных спектральных характеристик достоинство аналога AkaLumine-HCl заключается в более удачном биораспределении в клетках глубоких тканей и более эффективном, чем в случае D-люциферина, насыщении светляковой люциферазы Fluc. Направленный мутагенез Fluc привел к получению искусственной люциферазы Akaluc, более активной с синтетическим субстратом, чем природная [10]. Разработанная система AlaBLI почти в 100–1000 раз ярче, чем существующие, и пригодна для биоимиджинга отдельных клеток в глубоких тканях свободно движущихся животных.

Технологически осуществить одновременный анализ сигналов от разных процессов можно с помощью светового фильтра при совместном применении разных биолюминесцентных систем (например, в стандартном Promega DLR assay используют P. pyralis и R. reniformis) либо при использовании нескольких мутантных белков в рамках одной биолюминесцентной системы. В качестве примера последнего можно привести недавно предложенный метод DART, в котором применяются зеленый (PLG) и красный (PLR1) мутанты люциферазы светляка совместно с D-люциферином и его бензотиофеновым аналогом соответственно [11]. Недостатком указанных методов является ингибирование светового сигнала люциферазами в первом случае либо возможные перекрестные реакции родственных люцифераз с аналогичными субстратами во втором.

По аналогии с упомянутой выше системой AlaBLI, интересным подходом к преодолению существующих недостатков является разработка полностью искусственных люцифераз, работающих со стандартными субстратами на основе генетических последовательностей уже известных белков, например полученная недавно серия Aluc, представители которой работают с целентеразином и аналогами (λmax = 487–500 нм) [12]. Химическая модификация целентеразина путем конъюгации с флуоресцентными красителями позволила сместить максимум эмиссии в реакции с Aluc в еще более длинноволновую область [13]. Близкий по идее подход через предварительные расчеты выявил несколько ортогональных пар «аналог D-люциферина — мутантная люцифераза Fluc», для которых активность была подтверждена in vivo [14].

Удобство применения люцифераз морских организмов обусловлено, в первую очередь, отсутствием кофакторов в реакции люминесценции, что существенно упрощает анализ и позволяет использовать их для имиджинга вне живой клетки. Особенно популярной стала специально полученная люцифераза NanoLuc. Ее миниатюрные размеры упрощают разработку новых гибридных белков «люцифераза — флуоресцентный белок», используемых для расширения имиджинговой палитры с помощью BRET. Феномен BRET основан на Ферстеровском резонансном переносе энергии (FRET) от люциферазы к флуоресцентному белку, в результате чего максимум эмиссии оказывается в смещенном диапазоне. Из люциферазы NanoLuc и соответствующих белков была создана целая палитра химерных белков, в которых с помощью разных флуорофоров максимум эмиссии сдвинут вплоть до 680 нм [15]. В качестве аналогичного примера можно упомянуть недавно разработанные химерные белки Rluc8-iRFPs, также работающие в длинноволновой области [16].

Расширение палитры: новые люминесцентные системы

Для решения задачи расширения доступной биолюминесцентной палитры не менее перспективен подход по изучению новых, ранее не исследованных люминесцентных систем. Например, не так давно были установлены структуры люциферинов почвенного червя Fridericia heliota max = 480 нм) и люциферина грибов (λmax = 530 нм) [3]. Для последнего уже получена рекомбинантная люцифераза [17]. Себестоимость люциферина грибов в десятки раз ниже, чем самого популярного D-люциферина, а стабильность его намного выше. Принципиальная возможность легко модифицировать структуру люциферина и получать функциональные аналоги, испускающие свет в более длинноволновом диапазоне [18], делает новую биолюминесцентную систему грибов весьма привлекательной для использования в биоимиджинге. Некоторым осложнением могут стать необходимость участия кофакторов в реакции и мембранная локализация люциферазы грибов.

В 2018 г. была выделена люцифераза морской полихеты Odontosyllis undecimonta [19]. Данный белок не проявляет люминесцентную активность с уже известными люциферинами морских организмов (целентеразин, люциферин Cypridina). Таким образом, впервые за долгое время охарактеризована люцифераза морского организма, относящаяся к принципиально новому типу биолюминесцентной системы, т. е. ортогональная всем изученным ранее. Максимум биолюминесценции Odontosyllis in vivo находится в области 510 нм. Реакция между люциферином и люциферазой Odontosyllis так же, как и в случае других морских люминесцентных систем, не требует участия кофакторов. Как только будет расшифрована структура люциферина Odontosyllis и разработан метод его синтеза, эта биолюминесцентная система будет активно применяться в биоимиджинге.

ВЫВОДЫ

Огромное разнообразие методов многоцветного биоимиджинга позволяет выбрать оптимальный для решения конкретной задачи в медицинском исследовании. Наиболее чувствительны методы биолюминесцентного имиджинга, однако их использование для многоцветного мечения сдерживается недостаточным количеством доступных пар люцифераза–люциферин. Удачным расширением палитры инструментов могут стать недавно изученные биолюминесцентные системы высших грибов и морской полихеты Odontosyllis, обладающие рядом преимуществ по сравнению с теми, которые популярны на данный момент.

КОММЕНТАРИИ (0)