Рис. 1. Замороженные срезы нормальной печени (A), метастазов печени (Б), нормальной толстой кишки (В) и первичной опухоли (Г), которые были зафиксированы в 4%-м растворе формальдегида, после чего их инкубировали с лишенными метки кремниевыми наночастицами CGIYRLRS- или CGVYSLRS-(Rhod+Cy5) в течение 4 ч при комнатной температуре. После промывания испускаемую кремниевыми НЧ флуоресценцию проанализировали методом конфокальной микроскопии, а ответ преобразовали в ложно-цветное изображение LUT Fire для быстрой визуализации. Ядра были окрашены 4’, 6-диамидин-2-фенилиндолом (ДАПИ). Солокализованные пиксели идентифицировали с помощью программного обеспечения ImageJ. В ходе экспериментов, показавших схожие результаты, использовали образцы, отобранные у 10 пациентов с метастатическим колоректальным раком; на примере представлены изображения тканей пациента #P85. (Д) Количественно связывание кремниевых НЧ выражается как интенсивность испускаемых пикселей после облучения на 514 нм (Rhod) и 633 нм (Cy5) и представляет собой среднее значение для пяти изображений каждой ткани. (По данным: Soster и др. [5].)

Рис. 2. Мышам с диабетом без ожирения/тяжелым комбинированным иммунодефицитом, имеющим первичные опухоли и множественные метастазы в печени, ввели одноцветные кремниевые НЧ (контроль (A, Rhod; Б, Cy5) или НЧ CGIYRLRS (Г, Rhod; Д, Cy5)), двухцветные НЧ (контроль (В) или НЧ CGIYRLRS (Е)). Через 16 ч мышей усыпили, а извлеченные органы сфотографировали на цифровую камеру высокого разрешения, подключенную к флуоресцентному стереомикроскопу. На рис. Г, Д и Е оранжевыми стрелками отмечены кровеносные сосуды, проходящие через метастазы печени; на рис. Д и Е белыми стрелками с субмиллиметровой точностью отмечены скопления метастазов. Образцы одних и тех же тканей заморозили методом ОСТ, порезали на срезы толщиной 10 мкм и исследовали методом конфокального анализа одноцветной (контроль (Ж, Rhod; И, Cy5), CGIYRLRS (З, Rhod; К, Cy5)) или двухцветной (контроль (Л), CGIYRLRS (М)) флуоресценции. Для визуализации кровеносных сосудов окрашивание CD31 было наложено на сигнал кремниевых НЧ и визуализировано с помощью вторичных антител Alexa Fluor®647 (Ж–З), Alexa Fluor®488 (И–К) и DyLightTM405 (Л–О), для перекрывания с сигналом НЧ (Rhod), (Cy5) и двухцветных НЧ соответственно. В случае с двухцветными кремниевыми НЧ на образцах первичных опухолей, взятых у мышей, которым ввели контроль (Н) или CGIYRLRS (О), кремниевые НЧ визуализируются как негативный контроль для дальнейшего использования. На рис. П (фрагмент поля на К) и P (фрагмент поля на М) представлены трехмерные модели, полученные из 50–80 конфокальных снимков с помощью программного обеспечения IMARIS. (По данным: Soster и др. [5].)

Рис. 3. Терапевтическая эффективность нацеленных на аминопептидазу N (APN) и A (APA) липосомных препаратов на модельных мышах с нейробластомой. Бестимусные мыши (по 8 в группе), которым провели ортотопическую имплантацию клеток человеческой нейробластомы, начиная с 21-го дня после имплантации получали лечение с использованием буферного раствора HEPES (контроль), стелс-липосом CNGRC-SL[пустых], стелс-липосом CPRECESSL[пустых] или доксорубицина в дозировке 5 мг/кг, свободного или инкапсулированного в лишенные метки липосомы (SL[DXR]), липосомы, нацеленные на APN (CNGRC-SL[DXR]) или APA (CNGRC-SL[DXR]) или эквимолярную смесь CNGRC-SL[DXR] и CNGRC-SL[DXR] (COMBO), один раз в неделю в течение 5 недель. Эффективность каждого препарата оценивали по выживаемости, которая представлена на кривой Каплана–Майера в виде процента оставшихся в живых мышей для разных временных точек. (По данным: Loi и др. [18].)

Рис. 4. A. Терапевтическая эффективность нацеленных на пептиды липосомных препаратов на модельных мышах, которым провели имплантацию экспрессирующих люциферазу клеток человеческой неробластомы. Лечение начали через 21 день после имплантации опухоли. Мышам (по 5 в группе) внутривенно вводили буферный раствор HEPES (контроль) или доксорубицин в дозировке 5 мг/кг, свободный (free DXR) или инкапсулированный в лишенные метки стелс-липосомы (SL[DXR]), липосомы с пептидной смесью (SCR-SL[DXR] или усовершенствованные пептидами липосомы направленного действия (1-, 5-, 8-, 10-, 14-SL[DRX]), один раз в неделю в течение трех недель. Мониторинг роста опухоли проводили методом биослойной интерферометрии (BLI) через 5 дней после каждого эпизода получения лечения (26-й, 33-й, 40-й день с момента имплантации опухоли). Представлены значения увеличения объема опухоли по сравнению с днем, предшествовавшим началу лечения (20-й день). На рисунках представлены рентгеновские снимки, полученные через месяц после окончания лечения (65-й день), для мышей, получавших SL[DXR], 5-SL[DXR] и 10-SL[DXR] соответственно. Б–В. Терапевтический эффект препаратов направленного действия оценивали по общей выживаемости для псевдо-метастатической модели (13 животных в группе; Б) и для ортотопической модели (8 животных в группе; В). Статистический анализ: A, p vs. SL[DXR]; Б–В, p vs. контроль, SL[DXR] и SCR-SL[DXR]. (По данным: Loi и др. [16].)

Рис. 5. A. Системная проницаемость In vivo. Мыши, имеющие ортотопические опухоли (по 3 в группе) 28 дней спустя получали одну дозу доксорубицина (5 мг/кг), инкапсулированного в лишенные метки стелс-липосомы (SL[DXR]) или нацеленные на HSYWLRS липосомы (HSYWLRS-SL[DXR]), вместе с 1 мг голубого Эванса. Мыши из контрольной группы (CTR) получали только буферный раствор HEPES. Через час мышам выполняли перфузию, извлекали опухоли и печень, экстрагировали голубой Эванс и измеряли его количество (на 600 нм). Результаты выражены в количестве голубого Эванса на 1 г ткани. * *, p < 0,01: HSYWLRS-SL[DXR] vs. контроль и SL[DXR]. Б. Примеры срезов опухолей мышей из контрольной группы или мышей, получавших SL[DXR] или HSYWLRS-SL[DXR], которым ввели ФИТЦ-лектин (зеленый). Красный: CD31. Синий: клеточные ядра (ДАПИ). Шкала: 40 мкм. На графике справа количество ФИТЦ-положительных клеток. * * *, p < 0,001, HSYWLRS-SL[DXR] vs. контроль и SL[DXR]. В. Потенцированная терапевтическая эффективность HSYWLRS-SL[DXR]. Мышам (по 8 в группе), имеющим ортотопические опухоли, внутривенно вводили доксорубицин в дозировке 5 мг/кг, свободный или инкапсулированный в стелс-липосомы SL[DXR] и HSYWLRS-SL[DXR], один раз в неделю в течение 3 недель (стрелки). Мыши из контрольной группы (CTR) получали только буферный раствор HEPES. Выживаемость: p < 0,0008: HSYWLRS-SL[DXR] vs. SL[DXR]). Вставка: средняя масса тела для разных временных точек. (По данным: Cossu и др. [17].)

Рис. 6. A. Латеральные (со стороны опухоли) изображения мышей, которым была проведена ортотопическая имплантация экспрессирующих люциферазу клеток человеческой нейробластомы. Животные получали лечение внутривенно, один раз в неделю в течение 2 недель (стрелки), с использованием доксорубицина в дозировке 5 мг/кг — свободного (free DXR) или инкапсулированного в нацеленные на HSYWLRS липосомы (HSYWLRS-SL[DXR]). Мыши из контрольной группы (CTR) получали буферный раствор HEPES. Мониторинг роста опухоли проводили методом биослойной интерферометрии (BLI) на 20-й день (перед началом лечения) и на 40-й день (окончание лечения) после появления опухоли. Б. Противоопухолевый эффект после окончания лечения, значение представлено как увеличение объема опухоли на 40-й день по сравнению с 20-м днем. *, p < 0,05: свободный доксорубицин vs. контроль; * *, p < 0,01: HSYWLRS-SL[DXR] vs. свободный доксорубицин; * * *, p < 0,001: HSYWLRS-SL[DXR] vs. контроль. В. HSYWLRS-SL[DXR] демонстрирует потенцированную терапевтическую эффективность. Выживаемость: p < 0,0025: HSYWLRS-SL[DXR] vs. контроль и свободный доксорубицин. (По данным: Cossu и др. [17].)

Рис. 7. Лечение с помощью HSYWLRS-SL[DXR] ингибирует вторичное распространение опухоли. Мыши (4 из контрольной группы, 5 получавших препарат), которым была проведена ортотопическая имплантация экспрессирующих люциферазу клеток человеческой нейробластомы, получали лечение, описанное в подписи к рис. 6. Оценка распространения опухоли была проведена методом ПЭТ через 41 день (A). Карты поглощения глюкозы (белые стрелки: первичная опухоль; черные стрелки: метастазы). Количество (Б) и объем метастазов (В) после лечения. *, p < 0,05: свободный доксорубицин vs. контроль; * *, p < 0,01: HSYWLRS-SL[DXR] vs. свободный доксорубицин; * * *, p < 0,001: HSYWLRS-SL [DXR] vs. контроль