Антибактериальная фотодинамическая терапия (АФДТ) является перспективным способом лечения локальных инфицированных очагов, в частности хирургических и ожоговых ран, трофических и диабетических язв [1, 2]. При АФДТ в отличие от антибиотикотерапии разрушение бактериальных клеток происходит без развития резистентности в ответ на лечение [3–6]. Большинство патогенных микроорганизмов, в том числе устойчивые к антибиотикам штаммы бактерий, восприимчиво к АФДТ [7].
В локальных инфицированных очагах, в частности инфицированных ранах, наиболее часто обнаруживаются грамположительные бактерии Staphylococcus aureus (S. aureus), грамотрицательные бактерии Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa) и Klebsiella pneumoniae (K. pneumoniae), штаммы которых могут обладать множественной антибиотикорезистентностью, приводить к переходу процесса в хроническое состояние и различным опасным последствиям для пациентов [8].

Грамположительные и грамотрицательные бактерии имеют принципиальные различия в своем строении и чувствительности к лекарственному воздействию. Клеточная стенка грамположительных бактерий не оказывает существенного влияния на проникновение в них большинства фотосенсибилизаторов (ФС). У грамотрицательных бактерий она обладает дополнительным структурным элементом — наружной мембраной толщиной 10–15 нм, имеющей гетерогенный состав (белки с пориновой функцией, липополисахаридные тримеры и липопротеины, создающие внешнюю псевдоповерхность плотно упакованных отрицательных зарядов) [9–11]. Такая система препятствует проникновению гуморальных защитных факторов организма и является причиной устойчивости ко многим лекарственным препаратам: через пориновые каналы диффундируют только относительно гидрофильные соединения с молекулярной массой ниже 700 Да, а при увеличении размеров и массы молекул вероятность их диффузии внутрь грамотрицательных бактерий снижается. С грамотрицательными бактериями эффективно взаимодействуют только катионные ФС [10, 11]. Дополнительным преимуществом катионных ФС может быть возможность использования для сенсибилизации их высококонцентрированных водных композиций (растворов или нанодисперсий), поскольку кулоновское отталкивание молекул катионных бактериохлоринов может частично уменьшить их агрегацию [12], снижающую эффективность фотодинамических процессов.

При выборе ФС для АФДТ необходимо иметь в виду, что глубина очагов инфекционного поражения некоторыми бактериями, например P. аeruginosa, может достигать 12–15 мм [13], делая неэффективным применение как обычных аппликационных антибактериальных средств (растворов, мазей, гелей), так и ФС, проявляющих фототоксичность при возбуждении в видимом диапазоне спектра. Поэтому для надлежащего фотодинамического воздействия на такие очаги необходимо использовать для АФДТ ФС ближнего инфракрасного диапазона, возбуждение которых осуществляется в «спектральном окне прозрачности биологической ткани» (720–850 нм). В связи с этим в качестве ФС для АФДТ активно исследуют катионные производные бактериохлоринов. Исследования, проведенные на поликатионных производных синтетических бактериохлоринов с молекулярной массой 1500–1800 Да, показали, что эти ФС обеспечивают инактивацию как грамположительных бактерий S. aureus, так и грамотрицательных бактерий P. aeruginosa, однако значения минимальной бактерицидной концентрации при использовании этих ФС достаточно высоки (> 6 мкМ на S. aureus, около 25 мкМ на P. aeruginosa) [14].

Задача повышения эффективности антибактериальной ФДТ делает актуальными создание и исследование ФС на основе поликатионных синтетических бактериохлоринов с уменьшенными размером молекулы и молекулярной массой. Целью работы было изучить в широком диапазоне концентраций фотофизические и антибактериальные свойства наноструктурированного ФС на основе тетракатионного амфифильного производного синтетического бактериохлорина мезо-тетра(1-гептил-3-пиридил)бактерио-хлорина тетрабромида 3-Py₄BСHp₄Br₄.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Тетракатионное амфифильное производное синтетического бактериохлорина — мезо-тетра(1-гептил-3-пиридил) бактериохлорина) тетрабромид 3-Py₄BСHp₄Br₄ — обладает меньшей степенью липофильности и меньшим радиусом молекулы по сравнению с производным, описанным ранее [14]. Оно было синтезировано алкилированием мезо-тетра(3-пиридил)бактериохлорина бромистым гептилом в нитрометане в инертной атмосфере. Наноструктурированную дисперсию 3-Py₄BСHp₄Br₄ получили путем его солюбилизации в 4%-й дисперсии Kolliphor ELP (BASF; Германия). Гидродинамический размер наночастиц, по результатам измерений на приборе Zetasizer Nano Series ZS 3600 (Malvern Panalitical; Великобритания), лежит в пределах 12–14 нм.

Поглощение ФС в диапазоне концентраций 0,001–0,1 мМ изучали на двухлучевом спектрофотометре Hitachi U-3410 (Hitachi; Япония), а спектрально-флуоресцентные исследования проводили с использованием спектроанализатора ЛЭСА-01-Биоспек (ООО БИОСПЕК; Россия). Флуоресценцию возбуждали лазерным излучением с длиной волны 532 нм, попадающей в Q2-полосу производного бактериохлорина. Для изучения особенностей формы спектральной полосы спектрально-флуоресцентные исследования ФС проводили в кюветах разной длины (1 мм и 10 мм), а спектральную интенсивность флуоресценции дополнительно нормировали на интенсивность флуоресценции в спектральном максимуме ее полосы (приводили спектральный максимум к 1). Это позволило при анализе спектров разделить изменения, связанные с перепоглощением и агрегацией.

Для измерения времени жизни люминесценции водных композиций исследуемых ФС использовали спектрометр с время-разрешающей регистрацией. Спектрометр включал в себя пикосекундный импульсный лазерный источник с оптоволоконным выходом Picosecond Light Pulser PLP-10 (Hamamatsu; Япония), генерирующий импульсное лазерное излучение с длиной волны 637 нм и длительностью импульса 65 пс, полихроматор Jarrell-Ash (Division of Fisher Co; США) с оптоволоконным входом и оптическим фильтром Semrock LD01-785/10-12.5 (Semrock Inc; США) на входе, который пропускал только спектральную область полосы люминесценции производных бактериохлоринов и минимизировал влияние сторонних засветок. Полученный сигнал аппроксимировали суммой нескольких экспонент.
Изучение фотоинактивации планктонных бактерий проводили на клинических изолятах S. aureus 15, P. aeruginosa 32, K. pneumoniae 1556. Бактерии выращивали в питательном бульоне LB или на 1%-м агаре LB (Difco; США). Для планктонных культур определяли минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) ФС в стандартных условиях: инкубация бактерий с ФС в течение 30 мин, плотность дозы облучения — 20 Дж/см².
Исходный титр бактерий составляли 1 • 10⁸ КОЕ/мл (колониеобразующих единиц в миллилитре). Использовали двукратные разведения ФС, начиная с 1 мМ. После инкубации бактериальную суспензию центрифугировали в течение 5 мин при 7000 об./мин на лабораторной центрифуге Eppendorf (Eppendorf; Германия), ФС удаляли, бактерии ресуспендировали в физиологическом растворе, суспензии каждой концентрации (а также контроль без ФС) разливали по 100 мкл в лунки двух 96-луночных плоскодонных планшетов. Один из них был предназначен для опыта с облучением, другой для контроля без облучения.
Для облучения использовали светодиодный источник СФД-М-760 (АНО «МИКЭЛ»; Россия) с длиной волны спектрального максимума 760 нм и полушириной спектральной полосы, равной примерно 35 нм. Плотность мощности составляла 22–25 мВт/см2, длительность облучения — 20 мин. Для контроля плотности мощности использовали измеритель Coherent labmax (Coherent; США) с диафрагмой.
После облучения 50 мкл из каждой лунки высевали на чашки Петри с агаром LB, инкубировали в темноте при 37 °С в течение 20 ч. Отмечали наименьшую концентрацию ФС, высев из которой не давал роста. Эту концентрацию принимали за МБК.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Изучение зависимости поглощения 3-Py₄BСHp₄Br₄ от его концентрации в нанодисперсии проводили для оценки выраженности агрегационных процессов. Рабочая полоса поглощения 3-Py₄BСHp₄Br₄ имеет узкий спектральный контур (полуширина составляет примерно 22 нм) с максимумом около 760 нм. Исследования показали, что в отличие от поликатионных фталоцианинов признаки агрегации в спектрах поглощения дисперсии 3-Py₄BСHp₄Br₄ не выражены [15]: форма спектра поглощения не изменяется при увеличении концентрации; зависимость оптической плотности от молярной концентрации линейна (выполняется закон Бугера) и согласуется со значениями экстинкции, определенными при низких концентрациях (рис. 1).
Для подтверждения высказанного предположения о невысокой степени агрегации изучаемого ФС проводили спектрально-флуоресцентные исследования его нанодисперсии. Изучали форму и интенсивность спектров флуоресценции, а также излучательное время жизни возбужденного состояния 3-Py₄BСHp₄Br₄ при высоких и низких значениях концентрации.
Анализ приведенных спектров флуоресценции ФС показывает, что увеличение длины кюветы от 1 до 10 мм при низких (0,005 мМ) значениях концентрации не влияет на форму спектрального контура (рис. 2, спектры 1, 2), приводя только к незначительному (на 0,3 нм) сдвигу спектрального максимума из-за перепоглощения. При этом полоса флуоресценции остается узкой (27 нм).
При высоких (0,05 мМ) значениях концентрации, примерно соответствующих концентрации ФС в плазме крови через 1 ч после внутривенного введения, из-за перепоглощения происходит длинноволновое смещение спектрального максимума полосы флуоресценции, зависящее от длины кюветы (на 1,5 нм — в кювете длиной 1 мм и на 3,4 нм — в кювете длиной 10 мм). При этом увеличивается и полуширина полосы флуоресценции (в кювете 1 мм — на 1,1 нм, а в кювете 10 мм — на 4,3 нм), но форма спектрального контура не меняется, в нем не появляются дополнительные батохромно и гипсохромно сдвинутые пики.
Исследование излучательного времени жизни с использованием ранее описанного подхода [16] показало наличие двух компонент. Доминирующей при исследованиях в воде является компонента со средним значением времени жизни, равным 2,8 нс, доля которой составляет примерно 86%. В плазме крови, где агрегация снижается, доминирующая компонента со средним значением времени жизни, равным около 2,9 нс, составляет почти 100%.
Зависимость интегральной интенсивности флуоресценции дисперсии от концентрации ФС близка к линейной до 0,03 мМ (рис. 3), а при более высоких концентрациях становится сублинейной. Такая же зависимость наблюдается для композиции 3-Py₄BСHp₄Br₄ в плазме крови. При этом форма кривых почти не изменяется, хотя интенсивность флуоресценции в плазме крови выше по сравнению с интенсивностью флуоресценции в воде в 1,3–1,4 раза.
Результаты определения МБК 3-Py₄BСHp₄Br₄ в стандартных условиях представлены в таблица.

ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты исследования поглощения ФС свидетельствуют о невысокой степени их агрегации в изучаемом диапазоне концентраций [15], поскольку во всем диапазоне его концентраций форма и полуширина спектра полосы поглощения не изменяются, а поглощение линейно зависит от концентрации.
Анализ особенностей изменения формы спектральной полосы флуоресценции при увеличении концентрации и длины кюветы позволяет предположить, что наблюдаемые явления, происходящие при высокой концентрации изучаемого ФС, связаны преимущественно с перепоглощением; при этом имеет место и агрегация, но вклад ее незначителен. Об этом же свидетельствуют результаты изучения излучательного времени жизни возбужденного состояния ФС на основе 3-Py₄BСHp₄Br₄ и зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации 3-Py₄BСHp₄Br₄ в дисперсии, особенно в плазме крови [17–21].
Эти данные позволяют сделать вывод, что эффективность фотодинамических процессов при высоких концентрациях 3-Py₄BСHp₄Br₄ не будет снижаться и дает возможность использовать нанодисперсии 3-Py₄BСHp₄Br₄ с такими концентрациями для сенсибилизации при АФДТ.
По сравнению с ФС на основе катионных бактериохлоринов, описанных ранее [14], 3-Py₄BСHp₄Br₄ имеет значительно более низкие значения МБК для грамположительных бактерий S. aureus и грамотрицательных бактерий P. aeruginosa в планктонном состоянии. Низкие значения МБК получены также для грамотрицательных бактерий K. pneumoniae.

ВЫВОДЫ

Результаты исследований показывают, что исследуемый тетракатионный ФС на основе синтетического амфифильного производного бактериохлорина 3-Py₄BСHp₄Br₄ с уменьшенными размером молекулы и молекулярной массой обладает высокой эффективностью фотодинамической инактивации грамположительных бактерий S. aureus и грамотрицательных бактерий P. aeruginosa и K. pneumoniae. Исследования фотофизических свойств ФС в широком диапазоне концентраций продемонстрировали его низкую агрегацию в воде и плазме крови. Результаты исследований позволяют сделать вывод, что ФС на основе наноструктурированной формы 3-Py₄BСHp₄Br₄ перспективен для фотодинамического лечения локальных инфицированных очагов, вызванных грамположительными и грамотрицательными бактериями.