DOI: 10.24075/vrgmu.2019.002

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Использование комбинации рибосомного и фагового дисплеев для быстрого отбора высокоаффинных VHH-фрагментов антител альпак

Ю. Е. Кравченко, С. В. Иванов, Д. С. Кравченко, Е. И. Фролова, С. П. Чумаков
Информация об авторах

Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, Москва, Россия

Для корреспонденции: Степан Петрович Чумаков
ул. Миклухо-Маклая, 16/10, г. Москва, 117997; moc.liamg@lukhtah

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, уникальный код проекта RFMEFI60716X0156.

Информация о вкладе авторов: Ю. Е. Кравченко выделяла генетический материал альпак, готовила РНК, проводила ИФА; С. В. Иванов конструировал библиотеки VHH-фрагментов антител, проводил селекцию методом фагового дисплея; Д. С. Кравченко нарабатывал белковые препараты, работал с эукариотическими клеточными культурами; Е. И. Фролова планировала исследование, проводила иммунизацию животных, редактировала рукопись; С. П. Чумаков планировал исследование, проводил селекцию методом рибосомного дисплея, анализировал результаты, писал рукопись.

Статья получена: 08.12.2018 Статья принята к печати: 22.12.2018 Опубликовано online: 24.02.2019
|

Селекция антител с помощью фагового дисплея предполагает предварительное клонирование репертуара последовательностей, кодирующих антигенсвязывающие участки, в фагмиду, что считается «бутылочным горлышком» метода, ограничивающим итоговое разнообразие библиотек и ведущим к потере слабо представленных вариантов еще до начала процедуры селекции. Отбор в бесклеточных условиях при помощи рибосомного дисплея лишен этого недостатка, однако отличается высокой чувствительностью к артефактам ПЦР и присутствию РНКаз. Целью работы было исследование эффективности сочетания двух методов: проведения предварительной селекции в бесклеточной системе для обогащения исходной библиотеки с последующим клонированием и заключительной селекцией при помощи фагового дисплея. Предполагалось, что такой режим селекции позволит устранить недостатки каждого из методов и повысить эффективность отбора. Для селекции использовали последовательности VHH-антител альпаки, удобные для построения иммунной библиотеки из-за отсутствия VL-доменов. Анализ иммунных библиотек из генов семейств VH3, VHH3 и VH4 показал, что в группах генов VH3 и VH4 доля VHH-антител незначительна, и селекция из комбинированной библиотеки менее эффективна, чем из библиотеки последовательностей семейства VHH3. Мы установили, что комбинация рибосомного и фагового дисплеев приводит к более высокому обогащению высокоаффинными фрагментами и позволяет избежать потери исходного разнообразия при клонировании. Комбинированный метод позволил получить большее количество различных высокоаффинных последовательностей, а все протестированные VHH-фрагменты оказались способными специфично распознавать мишень, в том числе в тотальных белковых экстрактах клеточных культур.

Ключевые слова: наноантитела, VHH-антитела, рибосомный дисплей, фаговый дисплей, биопаннинг, PDLIM4

КОММЕНТАРИИ (0)