DOI: 10.24075/vrgmu.2019.007

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Выявление мутации Ser450Leu в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis методом аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации ДНК

М. Л. Филипенко1, И. П. Оскорбин1, Е. А. Храпов1, Д. А. Шамовская1, А. Г. Чередниченко2, Я. Ш. Шварц2
Информация об авторах

1 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, Новосибирск, Россия

2 Новосибирский научно-исследовательский институт туберкулеза, Новосибирск, Россия

Для корреспонденции: Максим Леонидович Филипенко
Проспект академика Лаврентьева, д. 8/2, г. Новосибирск, 630090; moc.liamg@oknepiliflm

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена при финансовой поддержке проекта базового бюджетного финансирования № VI.62.1.5 «Синтетическая биология: разработка средств манипуляции генетическим материалом и создание перспективных препаратов для терапии и диагностики» (0309-2018-0003).

Вклад авторов в работу: М. Л. Филипенко — общий замысел работы, планирование экспериментов, анализ результатов экспериментов, написание статьи; И. П. Оскорбин — написание статьи; Е. А. Храпов — проведение экспериментов; Д. В. Шамовская — проведение экспериментов; А. Г. Чередниченко — анализ результатов экспериментов; Я. Ш. Шварц — планирование и анализ результатов экспериментов.

Статья получена: 07.12.2018 Статья принята к печати: 25.02.2019 Опубликовано online: 09.03.2019
|

Для выявления генетических мутаций широко используют достаточно трудоемкий и дорогостоящий метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Целью работы было оценить возможность применения двух схем метода аллель-специфичной изотермической петлевой амплификации (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) для выявления мутации TCG/TTG (S450L) в гене rpoB Mycobacterium tuberculosis. Использовали 48 клинических изолятов M. tuberculosis и 11 образцов мокроты, выбранных случайным образом и полученных в микробиологической лаборатории г. Новосибирска от пациентов с впервые выявленным заболеванием. Показано, что применение схемы анализа с использованием аллель-специфичного праймера FIP по сравнению с F3 имеет лучшую разрешающую способность: разница между временем амплификации мутации и аллеля дикого типа составила 22 ± 2,4 против 13 ± 4,1 мин (p = 0,0011). При использовании 100 геном-эквивалентов ДНК истинно положительный сигнал (амплификация гена rpoB с мутацией при использовании соответствующего аллель-специфического праймера) детектировался после 29,4 ± 3,4 мин. Положительный сигнал визуализировался после добавления в реакцию SYBR Green I, как при освещении дневным светом, так и при использовании трансиллюминатора с УФ-излучением. С помощью разработанного нами метода была проанализирована выборка ДНК 20 RIFR изолятов M. tuberculosis, несущих мутацию Ser450Leu в гене rpoB, 10 RIFR изолятов, несущих другие мутации в гене rpoB, а также 18 RIFs изолятов без мутаций; наличие мутаций в образцах было определено с помощью классического секвенирования по Сенгеру. Чувствительность и специфичность LAMP для выявления мутации Ser450Leu в гене rpoB составили 100%. Данный подход позволяет использовать в качестве ДНК грубые лизаты микобактерий, что сокращает тотальное время анализа до 1,5 ч.

Ключевые слова: Mycobacterium tuberculosis, лекарственная устойчивость, мутации, рифампицин, ген rpoB, изотермическая петлевая амплификация, LAMP

КОММЕНТАРИИ (0)