ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Гуморальный ответ на вирус Эпштейна–Барр при аллергии

Е. В. Свирщевская1, М. А. Симонова1, Е. В. Матушевская2, Г. В. Фаттахова1, С. В. Хлгатян3, Д. Ю. Рязанцев1, Д. Б. Чудаков1, С. К. Завриев1
Информация об авторах

1 Институт биоорганической химии имени М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова, Москва, Россия

2 Институт повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия

3 Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова, Москва, Россия

Для корреспонденции: Елена Викторовна Свирщевская
ул. Миклухо-Маклая, 16/10, г. Москва, 117997; ur.hcbi.liam@rivse

Информация о статье

Вклад авторов в работу: Е. В. Свирщевская — определение IgE титров на аллергены в сыворотках больных с аллергией и доноров, обработка данных, написание статьи; С. В. Хлгатян — подбор сывороток больных с аллергией и доноров различного возраста, типирование методом RIDA; Г. В. Фаттахова, Д. Б. Чудаков — определение IgE титров на аллергены в сыворотках больных с аллергией и доноров; Е. В. Матушевская — сбор сывороток больных с аллергией, обсуждение результатов и написание статьи; М. А. Симонова, Д. Ю. Рязанцев — постановка ПЦР; Д. Ю. Рязанцев — экспрессия в E. coli рекомбинантных белков ВЭБ, A. alternata и D. Farinaе; Д. Ю. Чудаков — наработка, очистка и характеристика рекомбинантных белков; С. К. Завриев — оптимизация ПЦР, участие в обсуждении результатов.

Статья получена: 12.09.2018 Статья принята к печати: 15.02.2019 Опубликовано online: 01.03.2019
|

Вирус Эпштейна–Барр (ВЭБ) относится к ДНК- содержащим вирусам, входящим в семейство Herpesviridae и вызывающим у человека различные заболевания — от респираторных до онкологических. Известно 8 типов герпесвирусов, поражающих человека. Вирус простого герпеса 1-го и 2-го типов, варицелла-зостер (тип 3), ВЭБ (тип 4) и цитомегаловирус (тип 5) широко распространены в человеческой популяции. Инфицирование герпесвирусами типов 6 и 7 и ассоциированным с саркомой Капоши вирусом типа 8 встречается реже. Каждый взрослый человек инфицирован хотя бы одним типом герпесвируса, что диагностируют по наличию специфических антител в сыворотке крови. Так, 80–95% людей — латентные носители ВЭБ и цитомегаловируса [1]. Латентная ВЭБ- инфекция ассоциирована с некоторыми онкологическими заболеваниями [13], рассеянным склерозом [45], системной красной волчанкой [6], отягощает течение вирусного иммунодефицита человека [7], провоцирует формирование аутоантител к ДНК и белкам человека [89]. Основные антигены ВЭБ — вирусный капсидный антиген, ранний антиген и ядерный антиген 1 (EBNA1) [1011]. Белок EBNA1 необходим для латентной стадии персистенции вируса. Антитела G-класса вырабатываются против этого антигена каждый раз при реактивации вируса и отражают суммарную латентную вирусную нагрузку.

Инфицирование ВЭБ происходит контактным путем через поцелуи, общую посуду, предметы личной гигиены. Заражение воздушно-капельным путем также возможно, но встречается реже. Передача вируса может происходить от матери к ребенку во время вынашивания и родов, а также при грудном вскармливании. По данным различных исследований, у 50% детей в возрасте до 3 лет выявляют антитела к ВЭБ [1213]. Передача осуществляется, по- видимому, через общую посуду и поцелуи.
Аллергия I типа характеризуется формированием гуморального IgE-опосредованного ответа на белки, входящие в состав безвредных микрочастиц — пыльцы, мертвых клещей домашней пыли, эпидермис домашних животных и др. [1415]. Показано, что в коже и бронхиальном эпителии больных с аллергией имеются значительные отличия от здоровых барьерных тканей [1617]. Целью данной работы была оценка гуморального ответа на ВЭБ у больных с аллергией на A. alternata и D. farinae.
Ранее нами был разработан метод анализа антител IgG1 к ВЭБ и IgE к различным аллергенам с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [1819]. Иммуно-ПЦР (иПЦР) является чувствительным методом, используемым для детекции антител в биологических жидкостях [2021]. Среди преимуществ иПЦР — линейность дозовых кривых в широком диапазоне концентраций, что позволяет определять титры специфичных антител с помощью меньшего количества разведения сывороток [1819].

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Сыворотки

В работе использовали сыворотки детей и взрослых с гиперчувствительностью к клещам домашней пыли и грибу Alternaria alternata. Все сыворотки получены из КПО ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва, РФ) с информированного добровольного согласия участников и собраны за период с 2009 по 2017 г. Пациенты проходили аллергодиагностику с использованием коммерческих наборов RIDA (Германия). Критерии включения в исследование сывороток больных с аллергией: наличие в них IgE к A. alternata или КДП D. farinae по анализу RIDA с классом 3 и более (максимум 6). Критерии исключения: пациенты, прошедшие аллерген- специфическую иммунотерапию; наличие перекрестной аллергии на A. alternata или КДП D. farinae. Донорами считали людей разных возрастов, у которых не были выявлены IgE к пыльцевой, бытовой или грибной панелям аллергенов.

Материалы

Для иПЦР использовали планшеты c высокой сорбирующей способностью (Costar; США), стрипованные планшеты для qiPCR Top Yield strips (ThermoFisher Scientific; США), твин-20, готовый раствор 3,3'5,5'-тетраметилбензидина (Sigma; США), козью сыворотку (Bovogen Biologicals; Австралия), биотинилированные моноклональные антитела к человеческим IgG1–IgG4 и IgE (Southern Biotech; США), мышиные антитела к IgA1, IgA2 человека, конъюгат козьих антител против IgG мыши с биотином и конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (BD Pharmigen; США), биотинилированный олигодезоксирибонуклеоид (ОДН) (Lumiprobe; Москва), стрептавидин (Sigma; США). В работе использовали рекомбинантные белки rEBNA1, Der f 2 и Alt a 1, полученные ранее в нашей лаборатории [18, 2223]. Остальные реактивы — фирмы Fluka (Швейцария).

Постановка иПЦР

Раствор рекомбинантного антигена rEBNA1 (10 мкг/мл) в карбонат-бикарбонатном буфере (0,05 М, pH 9,6) вносили в лунки стрипованного планшета для иПЦР в объеме 50 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 4 °C. По окончании инкубации лунки промывали трижды буфером TETBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 0,1% твин-20, pH 7,5). Образцы сывороток разбавляли в 10 раз буфером TETBS с 20%-й козьей сывороткой, делали пятикратные серии разведений и вносили в лунки планшета в объеме 25 мкл на лунку. Каждый образец вносили в трех повторах. В качестве отрицательного контроля использовали фетальную коровью сыворотку (FBS) в 6 повторах. Планшет инкубировали на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре. После инкубации с образцами сывороток планшет отмывали три раза буфером TETBS и вносили в его лунки раствор биотинилированных антител к человеческим иммуноглобулинам IgG1–IgG4 или мышиных антител к человеческим IgA1, IgA2 или IgM в TETBS с 20%-й козьей сывороткой (1 : 1000) в объеме 50 мкл на лунку. Планшеты инкубировали на шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре и далее промывали три раза буфером TETBS. Для анализа IgA1, IgA2 или IgM планшеты далее инкубировали с конъюгатом козьих антител против IgG мыши с биотином. После отмывки в лунки планшетов вносили 50 мкл стрептавидина (1 мкг/мл), инкубировали 10 мин, отмывали и вносили 5 пМ раствора ОДН в буфере TETBS с 20%-й козьей сывороткой в объеме 50 мкл на лунку и инкубировали на шейкере в течение 10 мин при комнатной температуре. По окончании инкубации лунки планшета промывали 3 раза буфером TBS (20 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,5). В лунки планшета вносили смесь для ПЦР в объеме 35 мкл на лунку, сверху вносили минеральное масло в объеме 30 мкл на лунку. ПЦР в реальном времени проводили на амплификаторе DTprime (ДНК-Технология; Россия) по следующему протоколу: начальная денатурация в течение 5 мин при 94 °C и далее 40 циклов: 15 с отжиг и элонгация при 60 °C, 5 с денатурация при 94 °C. На каждом цикле проводили измерение величины флуоресцентного сигнала от зонда при длине волны 520 нм. Результаты ПЦР анализировали с использованием программного обеспечения амплификатора. Для каждого образца вычисляли среднюю величину порогового цикла (Cq) и стандартное отклонение. Порог детекции рассчитывали как три стандартных отклонения для (Cq-), где (Cq-) — величина порогового цикла в отрицательных образцах. Титр сыворотки оценивали как максимальное разведение сыворотки, при котором соответствующий образец считали положительным.

Статистический анализ

Среднее и стандартное отклонения рассчитывали с помощью программного обеспечения Excel (Microsoft Office, 2003). Корреляцию между титрами IgG1-антител и группами пациентов оценивали с помощью параметрического χ2- теста Пирсона и t-теста Стьюдента. Результат считали статистически значимым при значении p < 0,05 в двустороннем анализе.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Особенности иммуно-ПЦР

Все исследования проведены методом иПЦР (таблица). Cтадии 0–3 аналогичны стадиям метода ИФА: нанесение антигена на подложку (стадия 0), инкубация с сывороткой крови (стадия 1), инкубация с биотинилированными антителами против IgG1 человека (стадия 2), инкубация со стрептавидином (ПЦР) или комплексом стрептавидин — перокисидаза хрена (ИФА) (стадия 3). Стадия 3 в иПЦР разделена на две и включает инкубацию со стрептавидином, а затем дополнительную инкубацию с ОДН, что позволяет увеличить чувствительность иПЦР. На стадии 4 проводили ПЦР или добавляли субстрат для пероксидазы хрена.
Стадия детекции в ИФА с помощью субстрата не является стандартизированной и варьирует от дня постановки и времени остановки реакции блоком. При анализе иПЦР сокращается примерно на 1 ч время постановки реакции; достигается стандартное проведение анализа, не зависимое от оператора; увеличивается чувствительность за счет получения более линейных данных [1819].

Характеристика IgE-ответа на аллергены

Для работы отобрали сыворотки больных с диагностированным с помощью коммерческой системы RIDA IgE-ответом на клещей Dermatophagoides farinae и гриб Alternaria alternata. Среди имеющейся коллекции сывороток отбирали образцы с классом выше 3. На рис. 1 представлено распределение больных по классам RIDA. В части образцов сывороток IgE-антитела не были выявлены ни к одному из 15 аллергенов трех групп (пыльцевая, бытовая и грибная). Такие сыворотки использовали в качестве донорских. Далее из имеющейся коллекции отобрали по 30 сывороток больных и доноров в возрасте 0–15 лет.

Характеристика общего гуморального ответа на ВЭБ

Для анализа профиля антител к ВЭБ у больных с респираторной аллергией на КДП и гриб A. alternata использовали пул 10 сывороток с классом 5–6, полученных от больных в возрасте 3–15 лет. В качестве контроля использовали пул сывороток 10 доноров такого же возраста. Титры антител в rEBNA1 падали в ряду IgM > IgG1 > IgA1 > IgA2 > gG2 (рис. 2) у доноров и в ряду IgM > IgA1 > IgG1 > IgA2 > IgG2 у больных. Титры IgG3 и IgG4 были низкими в обеих группах. Достоверные различия между больными и донорами наблюдали только по уровням IgG1 и IgA1. Отношение титров IgG1 к IgA1 для доноров и больных составило 9 и 0,4 соответственно, что показывает доминирование IgA ответа у больных с аллергией и IgG1 — у здоровых доноров.

Анализ IgG1 ответа на ВЭБ

При вирусных инфекциях в основном вырабатываются антитела класса IgG1. На рис. 3А представлено распределение титров IgG1 к ВЭБ в сыворотках больных с аллергией (сыворотки с аллергией на КДП и/или A. alternata) и доноров в зависимости от возраста. Показано, что инфицирование возникает в раннем возрасте в обеих группах. У некоторых 4–6-летних детей в обеих группах выявлялись титры IgG1 > 1000. Средний титр IgG1 в группе пациентов в возрасте 3–10 лет у больных и доноров составил 330 и 1500 соответственно, в возрасте 11–20 лет — 720 и 490, что показывает тенденцию к более ранней инфицированности/реактивности доноров. Из-за значительного разброса данных достоверных различий между группами не было. Не было также различий по уровню антител к ВЭБ между больными аллергией на КДП, гриб A. alternata и донорами (рис. 3Б).
Анализ доли индивидов, не имеющих антител к ВЭБ, имеющих низкие (< 100), средние (100–1000) и высокие (>1000) титры IgG1, показал, что в обеих группах 75% детей в возрасте 3–15 лет являются латентными носителями ВЭБ (рис. 4А); у 45% индивидов в обеих группах выявлялись антитела с низкими титрами. Различия наблюдались между группами по продукции антител с высокими титрами: 20% доноров имели титры антител больше 1000 (2000– 8000); у больных с аллергией таких детей было только 7% (рис. 4А), что показывает большую резистентность к инфекции при аллергии. При этом титры антител к ВЭБ в соответствующих группах были близкими (рис. 4Б).

Анализ IgА1- и IgM-ответов на ВЭБ

Выше было показано, что у больных с аллергией незначительно, но достоверно повышены антитела класса А1 (р = 0,03). Более детальный анализ показал, что основное различие наблюдается на ранней стадии инфицирования (рис. 5А). Средние титры IgA1 к ВЭБ у больных и доноров в возрасте 3–10 лет составили 425 и 265, в возрасте 11–30 лет — 690 и 370 соответственно. В обеих группах наблюдали рост титров антител с возрастом (рис. 5А). Интересно, что по титрам IgA1 к ВЭБ наблюдали разницу между больными с разным типом сенсибилизирующего аллергена. Титры IgA1 к ВЭБ были достоверно выше при аллергии на КДП (рис. 5Б), чем у больных с IgE к A. alternata и доноров.
Средние титры IgM к ВЭБ на порядок превышали титры иммуноглобулинов классов G и A в сыворотках как доноров, так и больных. Индивидуальные данные разбивали на низкие (< 5000) и высокие (> 15 000) титры (рис. 5В, Г). Доля высокотитровых по IgM индивидуумов в обеих группах составила 60%. В этой группе не наблюдали различий в изменении титров IgM в зависимости от возраста и среднего титра (рис. 5В). В группе с низкими титрами IgM у больных с аллергией антитела появлялись раньше, чем у доноров (рис. 5В) и средние титры были выше (рис. 5Г). Повышение титров IgM в этой группе наблюдали при аллергии как на КДП, так и на гриб A. alternata (рис. 5Г).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В процессе естественного инфицирования ВЭБ формируются антитела разных классов и субклассов. У человека имеются антитела классов M, A, G и E, включающие субклассы IgG1–IgG4 и IgA1–IgA2. Основной пул антител М-класса относится к врожденному иммунитету и их титры повышаются при первичном инфицировании; IgA обеспечивают защиту слизистых оболочек; IgE повышаются при паразитарных инфекциях и аллергии. В настоящее время считается, что IgA и IgE относятся к адаптивному иммунитету, поскольку для этого требуется переключение В-клеток с IgM на другие субклассы. Однако в последнее время ставится вопрос локального переключения В-клеток на синтез IgA- и IgE- антител без участия Т-клеток [23, 24], что соответствует функционированию врожденного иммунитета. Антитела А-класса обычно относят к ранним антигенам VCA и EA [25]. Антитела классов М и А к ранним антигенам служат маркерами реактивации вируса или вторичного заражения. Антитела А-класса к позднему антигену ВЭБ EBNA1 также выявляются и значительно повышаются, например, при раке носоглотки [26].
Полученные нами данные показывают, что у больных с аллергическими реакциями в более ранний срок и в более высоких титрах повышаются титры IgA1- и IgM- антител. При этом титры IgA2 были ниже, чем титры IgA1 и не различались между группами (данные не показаны). При аллергической реакции наблюдается воспалительная реакция в слизистых оболочках, повышается продукция цитокинов и хемокинов [17, 24], что способствует активации В-клеток. В случае высокотитровых сывороток продукция IgM в группах доноров и больных была сравнимой, что показывает равную эффективность иммунного ответа при реактивации вирусом B-клеток, синтезирующих IgM.

Основным протективным звеном адаптивного гуморального ответа являются IgG. Переключение В-клеток на синтез IgG происходит только при формировании антиген-специфичного Т-зависимого ответа на ВЭБ. Известно, что при противовирусном ответе доминирует IgG1-ответ [2728]. По литературным данным, при ответе на вирус гепатита В титры антител падают в ряду IgG1 > IgG4 > IgG3 > IgG2 [27], при ответе на ВЭБ IgG1>> IgG2, IgG3, IgG4 [28]. Полученные нами данные для доноров характерны для ответа на ВЭБ с доминированием IgG1. Для больных с аллергией средний уровень IgG1 был ниже, чем в группе доноров, и сравним с уровнем IgG2 (p = 0,14). Статистический анализ данных показал, что достоверные различия между больными с аллергией и донорами по титрам IgG1 возрастают с возрастом. Ранее противовирусный ответ у больных с аллергией не изучали. В целом, полученные данные позволяют предположить, что при респираторной аллергии можно наблюдать повышение количества IgA1- и IgM-антител к ВЭБ, что снижает его проникновение через эпителиальные барьеры и уменьшает общую вирусную нагрузку.

ВЫВОДЫ

Аллергия характеризуется повышенной реактивностью эпителиальных барьеров, что вызвано взаимодействием IgE с аллергенами. Повышение реактивности врожденной системы иммунитета, по-видимому, приводит к повышению противовирусного ответа на вирус Эпштейна–Барр, повышению титров IgA1 и IgM, снижению титров IgG1, коррелирующих с латентной вирусной нагрузкой.

КОММЕНТАРИИ (0)