Болезнь Паркинсона (БП) это прогрессирующее нейродегенеративное заболевание, характеризующееся гибелью дофаминергических нейронов в компактной части черной субстанции (кчЧС). В настоящее время основные методы терапии БП симптоматические и остается актуальным поиск нейропротекторных препаратов, способных замедлить или остановить течение данного заболевания [1, 2].
Наиболее часто в качестве модели паркинсонизма на животных используют токсическую модель с введением 6-гидроксидофамина (ГДА) — селективного катехоламинергического нейротоксина, действующего как прямой источник свободнорадикальных соединений и блокатор комплексов I и IV электронтранспортной цепи митохондрий [3]. Введение крысам ГДА в область ЧС приводит практически к полной гибели дофаминергических нейронов и их терминалей в стриатуме в течение первых 10–14 дней [4]. Применение антиоксидантных (АО) препаратов как до введения ГДА, так и сразу после операции, показывает их эффективность и наличие существенного нейропротекторного эффекта [5]. Это может быть связано с их прямым действием на образующиеся в результате окисления ГДА свободные радикалы и, отчасти, с влиянием на сам процесс аутоокисления ГДА [6]; при этом действие АО направлено скорее не на предотвращение развития патологии, а на инактивацию самого токсина как этиологического фактора.
В условиях моделирования ранней стадии паркинсонизма у крыс эффективное протекторное действие проявили АО-препараты карнозин и альфа-липоевая кислота (ЛК) [7]. В то же время представляет интерес оценка их эффективности при введении на более поздней стадии, когда уже произошла гибель нейронов и проявились нарушения в дофаминергической иннервации стриатума, что соответствует времени постановки диагноза и началу лечения пациентов с БП.
В связи с этим целью данного исследования было оценить влияние карнозина и ЛК на поведение и нейрохимические показатели ткани мозга крыс в модели поздней стадии паркинсонизма, индуцированного ГДА.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование проводили на 40 аутбредных крысах-самцах линии Wistar в возрасте 3 месяцев и массой тела 250–300 г, содержавшихся в стандартных контролируемых условиях вивария при 12-часовом световом цикле и свободном доступе к воде и пище.
Всех животных разделили на четыре группы: ложнооперированные животные (n = 9), получавшие эквивалентный объем растворителя (0,05% аскорбиновой кислоты), — группа «контроль» и животные трех экспериментальных групп, которым в начале исследования вводили в ЧС ГДА (Sigma; США) в дозе 12 мкг в 3 мкл 0,05%-го раствора аскорбиновой кислоты в соответствии с координатами атласа мозга крыс (АР = –4,8; L = 1,9; V = 8,0) [8]. Для анестезии применяли золетил 100 в дозе 3 мг/100 г и ксиланит в дозе 3 мг/кг массы тела внутримышечно; для премедикации использовали атропин в дозе 0,04 мг/кг массы тела подкожно за 10–15 мин до введения ксиланита. На 14-, 16-, 18- и 20-й дни после введения токсина животные первой группы (n = 9) получали внутрибрюшинно инъекции 0,9%-го раствора NaCl («ГДА + 0,9% NaCl»); второй и третьей групп (n = 11 и n = 11) — исследуемые вещества: карнозин дозой 50 мг/кг массы тела (Свидлайт АБ; Швеция) («ГДА + карнозин») и ЛК дозой 50 мг/кг массы тела (Chem–Implex Int`l Inc.; США) («ГДА + ЛК») соответственно.
На 21- и 22-й дни после введения токсина проводили физиологическое тестирование животных в тестах «открытое поле» (ОП) и «сужающаяся дорожка» (СД). Поскольку не все животные были способны пройти тест СД до конца, поведение животных на дорожке дополнительно оценивали по специальной шкале неврозоподобного состояния (табл. 1) [9]. На 25-й день эксперимента животных умерщвляли при помощи гильотины (НПК Открытая Наука; Россия) и извлекали на льду мозг, из которого выделяли дорсальный стриатум левого и правого полушарий для последующего биохимического анализа и фрагмент среднего мозга, содержащий ЧС, — для иммуногистохимического окрашивания. Полученные образцы хранили в жидком азоте.

Количественная оценка дофаминергических нейронов

Количественную оценку дофаминергических нейронов в области ЧС животных контрольной группы и группы «ГДА + NaCl» проводили с помощью специфического иммуногистохимического окрашивания тирозингидроксилазы (ТГ), ключевого фермента синтеза дофамина, иммунофлуоресцентным методом [10]. Образцы, фиксированные 4%-м формалином, пропитывали сахарозой, заключали в среду OCT Tissue Tek (Sigma; США) и готовили замороженные фронтальные срезы толщиной 12 мкм в области ЧС. Срезы инкубировали 24 ч с поликлональными кроличьими антителами к тирозингидроксилазе (T8700; Sigma; США) в разведении 1 : 800 во влажной камере при комнатной температуре. Связывание первичных антител визуализировали при помощи козьих антител, меченых флуорохромом CF488, выработанных против иммунглобулинов кролика (1 : 500; Sigma; США). Срезы заключали под покровное стекло в среду FluoroShield (Sigma; США) и фотографировали (не менее 8–10 срезов у животного с интервалом 36–48 мкм) под микроскопом Nikon Eclipse Ni-u (Nikon; США), при увеличении объектива ×10. Тела нейронов подсчитывали на поле зрения в программе ImageJ (NIH; США).

Содержание основных нейромедиаторных аминов и их метаболитов

Содержание основных нейромедиаторных аминов и их метаболитов: дофамина (ДА), 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты (ДОФУК), гомованилиновой кислоты (ГВК), 3-метокситирамина (3-МТ), норадреналина (НA), серотонина (5-ОТ) и 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-ГИУК) оценивали в стриатуме левого и правого полушарий с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией (ВЭЖХ/ЭД) на жидкостном хроматографе System Gold (Beckman Coulter Inc.; США), оснащенном амперометрическим детектором RECIPE EC 3000 (Recipe GmbH; Германия). Ткань мозга гомогенизировали в 20 объемах 0,1 N HClO₄ с добавлением диоксибензиламина (0,5 нмоль/мл) в качестве внутреннего стандарта, затем центрифугировали при 10 000 g в течение 10 мин, для анализа использовали супернатант [7].

Статистическая обработка данных

Использовали программу Statistica 10.0 (Dell. Inc.; США). Статистическую значимость различий определяли с помощью факторного дисперсионного анализа (ANOVA) и HSD теста Tukey для post hoc анализа. Попарное сравнение выборок проводили с использованием t-теста Стьюдента и U-критерия Манна–Уитни в зависимости от нормальности распределения значений. Различия считали значимыми при p < 0,05. Результаты представляли в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (M ± m).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Анализ неврологической симптоматики

Результаты теста СД показали наличие выраженных нарушений у животных, которым был введен ГДА (F(3,36) = 10,54; p = 0,001). В контрольной группе все животные проходили по дорожке в среднем за 13,88 ± 1,73 с, среди животных в группе «ГДА + NaCl» только 3 из 11 животных смогли пройти тест до конца. Остальные животные демонстрировали замирание и не справлялись с тестом за отведенное время. В связи с этим в качестве интегральной характеристики по данному тесту использовали балльную оценку неврозоподобного состояния (табл. 2). В обеих группах у животных, получавших карнозин или ЛК, выраженных нарушений в поведении не было отмечено, и по результатам post hoc анализа обе группы не отличались от контрольных животных, но значимо отличались от группы «ГДА + NaCl» (табл. 2).
Оценка поведения животных в тесте ОП не выявила значимых изменений горизонтальной активности среди всех экспериментальных групп (F(3,36) = 1,83; p = 0,16), однако попарное сравнение показало значимые различия между группами «контроль» и «ГДА + NaCl» (7,97 ± 0,42 и 4,21 ± 0,77; p = 0,001). Результаты дисперсионного анализа показали изменения вертикальной активности животных (F(3,36) = 3,04; p = 0,04). По результатам апостериорного анализа по этому параметру, среди всех экспериментальных групп вертикальная активность была значимо снижена только в группе «ГДА + 0,9% NaCl», но не у животных, получавших карнозин или ЛК (табл. 2).

Количество дофаминергических нейронов

Количество дофаминергических нейронов в кчЧС определяли по иммуногистохимической локализации маркера дофаминовых нейронов тирозингидроксилазы. Окрашивание срезов среднего мозга на фермент тирозингидроксилазу выявило гибель нейронов у всех животных, которым вводился ГДА (F(3,10) = 6,33; p = 0,01) (рис. 1), и отсутствие эффектов вводимых антиоксидантных препаратов (F(2,8) = 0,51; p = 0,61). Так, если у контрольных животных в исследуемой области кчЧС насчитывали в среднем 166 ± 48 нейронов, то у животных всех экспериментальных групп, которым вводили ГДА, — 4 ± 2, p = 0,01. Полученные данные подтверждают релевантность используемой модели.

Определение содержания медиаторов-моноаминов и их метаболитов

Факторный анализ содержания моноаминов и их метаболитов в стриатуме экспериментальных животных показал наличие изменений только в правом полушарии, в которое производили введение токсина (F(21,81) = 3,29; p = 0,001), но не в левом (F(21,69) = 1,15; p = 0,32). Однако попарное сравнение групп «ГДА + NaCl» с контролем выявило значимое повышение уровня ДОФУК (на 19,0 ± 5,3%) и ГВК (на 19,1 ± 3,8%) в левом полушарии при введении ГДА (рис. 2); при этом карнозин снижал ДОФУК до уровня контрольной группы.
В результате анализа содержания моноаминов в стриатуме правого полушария, у всех животных, которым вводили токсин, вне зависимости от терапии, наблюдали значительное снижение содержания ДА и его основных метаболитов (в среднем на 90%) (рис. 3). Интермедиат 3-MT снижался менее интенсивно (в среднем на 58%).
Статистически значимых изменений в содержании серотонина выявлено не было, а концентрация его метаболита ГИУК в этих условиях достоверно увеличилась (на 38%) по сравнению с контролем (рис. 4).
Достоверное увеличение содержание ДА в стриатуме (в 5,8 раза, p = 0,007) по сравнению с группой «ГДА + NaCl» наблюдали только у животных, получавших карнозин. При этом содержание метаболитов ДА (ДОФУК и ГВК) увеличивалось при введении карнозина в 3,4 (p = 0,04) и 8,8 (p = 0,01) раза, а при введении ЛК в 4,7 (p = 0,03) и 7,4 (p = 0,04) раза соответственно (рис. 3). Влияния исследуемых препаратов на уровень 3-МТ отмечено не было. Содержание серотонина и его метаболита ГИУК в группе, получавшей ЛК, снижалось примерно на 23% (p = 0,006) и 36% (p = 0,009) соответственно по отношению к группе «ГДА + NaCl». Карнозин не оказывал влияния на содержание серотонина и его метаболитов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведена комплексная оценка влияния АО карнозина и ЛК на поведение животных в физиологических тестах и на метаболизм ДА и серотонина в нервной ткани стриатума на модели паркинсонизма у крыс. Паркинсонизм индуцировали унилатеральным введением ГДА в ЧС, с инъекцией АО, начиная с 14-го дня после операции, чтобы исключить их влияние на аутоокисление токсина и процессы гибели нейронов, происходящие ранее.
Гибель нейронов и денервация ипсилатерального стриатума были подтверждены методом иммуногистохимического окрашивания дофаминергических нейронов ЧС и значительным снижением уровня ДА и его метаболитов в стриатуме правого полушария, в которое вводили токсин, при этом вне зависимости от терапии, уровень ДА и его метаболитов оставался сниженным относительно контроля. В то же время карнозин и ЛК повлияли на метаболизм ДА, увеличив содержание его метаболитов относительно группы животных, получавших токсин, при этом достоверное повышение содержания самого ДА наблюдали только в группе животных, получавших карнозин. Введение ЛК способствовало снижению серотонина и его метаболита ГИУК относительно группы, получавшей токсин. Учитывая, что серотонин усиливает активность нейрохимических механизмов двигательных нарушений при БП, а снижение серотонинергической нейротрансмиссии в системе базальных ядер головного мозга, напротив, оказывает антипаркинсонический эффект [11], установленное влияние ЛК на серотонинергическую иннервацию может вносить определенный вклад в устранение двигательных нарушений при паркинсонизме.
Физиологическое тестирование выявило снижение паркинсоноподобной неврологической симптоматики и значительно менее выраженные поведенческие нарушения у животных, получавших оба АО-препарата. Четырехкратное введение как карнозина, так и ЛК на 14–20-й дни эксперимента предотвращало развитие неврозоподобного состояния животных, вызванного ГДА.
На экспериментальных моделях токсин-индуцированного паркинсонизма у крыс показаны положительные нейропротекторные эффекты как карнозина [12], так и липоевой кислоты [13]. Оба препарата восстанавливали антиоксидантный статус мозга, снижали уровень перекисного окисления, а липоевая кислота также увеличивала двигательную активность животных [13].
Однако в данных исследованиях препараты вводились одновременно с токсином, и не была проведена оценка гибели нейронов ЧС. Это осложняет интерпретацию полученных результатов и оставляет открытым вопрос о механизмах действия данных соединений. Проведенное нами исследование позволяет обоснованно судить о симптоматических эффектах применения данных препаратов на поздних сроках развития экспериментального паркинсонизма.
В целом, полученные данные указывают на целесообразность применения изученных антиоксидантных препаратов в дополнение к базисной терапии паркинсонизма. Ранее уже было предложено использование липоевой кислоты в качестве дополнительной терапии к леводопе [14], а для сочетанного применения карнозина с леводопой даже была показана клиническая эффективность [15].

ВЫВОДЫ

При отсутствии прямого нейропротекторного эффекта нами было обнаружено значимое симптоматическое действие карнозина и ЛК, механизм которого связан с компенсаторным увеличением содержания ДА и его метаболитов и одновременным снижением уровня серотонина. В целом, полученный эффект предполагает возможность использования изученных антиоксидантов в качестве дополнительной симптоматической терапии БП.