Микробиота кишечника вносит существенный вклад в функционирование организма человека в норме и патологии. Считается, что микробиота участвует и в процессах, ассоциированных со старением: влияет на метаболизм глюкозы [1], на процессы атерогенеза и кардиоваскулярное здоровье [2]. Была обнаружена взаимосвязь микробиоты с неблагоприятными исходами старения, в том числе с синдромом хрупкости и различными гериатрическими патологиями [3]. Предполагают также, что микробиота кишечника «стареет» вместе с человеком: по мере накопления возраст-ассоциированных заболеваний в кишечнике снижается разнообразие микроорганизмов, растет представленность условных патогенов, таких как Clostridium difficile, C. perfringens, Escherichia coli, и уменьшается представленность «положительных» бактерий, таких как Lactobacillus, Bifidobacterium, а также бутиратпродуцентов, играющих важную роль в снижении уровня воспаления [4]. Повышаются уровни эндотоксинов, уменьшается количество масляной кислоты [5]. Таким образом, стареющая микробиота может стимулировать вялотекущее воспаление, лежащее в основе возрастных патологий.

Но есть особая «модель» старения — это долгожители. Они максимально эффективно реализуют свой потенциал, у них значительно отодвинуто во времени развитие возраст- ассоциированных заболеваний. В микробиоте кишечника долгожителей детектируются высокие уровни полезных бактерий, достаточные уровни разнообразия [6, 7]. Несмотря на преклонный возраст доноров, в микробиоте этих людей сохраняется про- и противовоспалительный потенциал. Возможно, это один из антифакторов риска старения, поиском которых озадачена современная наука. На территории России до недавнего времени работ, посвященных изучению состава микробиоты кишечника долгожителей с использованием методов секвенирования нового поколения, не было. Целью настоящей работы стало изучение состава микробиоты кишечника долгожителей и проведение сравнительного анализа с группой более молодых лиц, не имеющих хронических заболеваний, проживающих на территории г. Москвы, а также долгожителей других стран.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В одномоментное исследование были включены 20 человек. Критерии включения: возраст 97–100 лет (средний возраст 98 ± 1 год). Критерий исключения: прием антибактериальных, химиотерапевтических, пробиотических препаратов за три месяца до забора образца стула. Для всех членов этой группы провели физикальный осмотр, комплексную гериатрическую оценку, собрали подробный анамнез. В рамках гериатрической оценки изучали адекватность питания всех участников с помощью краткой шкалы оценки питания (mini nutritional assessment, MNA). В качестве сравнения была выбрана группа из 92 человек 25–76 лет, не имеющих на момент включения в исследование тяжелых соматических патологий; клинические показатели членов этой группы описаны ранее [8].

Для участников исследования в обеих группах было проведено секвенирование V3–V4 вариабельных участков гена 16S рРНК микробиоты кишечника по соответствующему протоколу на секвенаторе MiSeq Illumina (Illumina; США) согласно рекомендациям производителя. Подготовку библиотек проводили согласно протоколу производителя (16S Metagenomic Sequencing Library Preparation) с использованием Nextera XT Index Kit (Illumina). В анализе применяли платформу Knomics-biota [9]. Первичный анализ, фильтрацию ридов и идентификацию операционных таксономических единиц проводили с использованием QIIME 1.9 [10], реконструкцию метаболических путей — с использованием алгоритма PICRUSt [11]. Для статистической обработки применяли язык Python v. 3.2. Все результаты исследования представляли с поправкой на множественное сравнение и пол в группе долгожителей (тест MaAsLin) [12], с поправкой на множественное сравнение, возраст и пол при межгрупповом сравнении. Все вошедшие в анализ образцы (n = 112) соответствовали критериям качества по количеству картированных видов >70%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Состав микробиоты кишечника у членов группы долгожителей

При изучении микробиоты долгожителей было обнаружено, что наиболее представленными микроорганизмами оказались симбиотические бактерии, многие из которых являются производителями масляной кислоты — семейств Christensenellaceae, Ruminococcaceae, и рода Ruminococcus. Все образцы близки к энтеротипу Ruminococcus [13]. Условно их можно разделить на кластеры, но с низкой силуэтной шириной. Фактически все образцы оказались относительно схожими между собой. Среднее значение показателя альфа-разнообразия микробиоты (индекс Шеннона) составило 6,3 ± 0,59. При этом интересным представляется распределение бактерий по филумам. В группе долгожителей относительно низким оказалось содержание бактерий филума Bacteroidetes, средняя представленность которых составила всего 7,8% при среднем значении Firmicutes, равном 78,7% (рис. 1).
Клиническая характеристика изучаемой когорты долгожителей представлена в табл. 1.

Сравнение состава микробиоты кишечника долгожителей с таковым у лиц более молодого возраста

Состав микробиоты кишечника в группе относительно здоровых лиц младшего возраста представлял собой нормальный состав микробиоты кишечника здоровых людей. По результатам использования QIIME 1.9, средняя представленность Bacteroidetes в группе составила 20,23%, Firmicutes — 73,4% (см. рис. 1). При сравнении групп различия в представленности Bacteroidetes были значимыми (adj. p < 0,002; MaAsLin тест).
Показатель альфа-разнообразия микробиоты группы лиц более молодого возраста был представлен на уровне 7,56 ± 0,49, что выше, чем в группе долгожителей, однако значимости различие не достигло (p = 0,10).
Примечательными представляются находки, полученные в ходе сравнения микробиоты кишечника двух групп на уровне родов и видов. Уже с помощью PCoA (Principal Coordinate Analysis) можно увидеть, что образцы долгожителей и образцы более молодых условно здоровых участников исследования различаются (рис. 2).
После более подробного анализа были найдены различия микробиоты долгожителей, в составе которой оказалось значительно больше положительных бактерий, таких как Bifidobacterium и Coprococcus (табл. 2).
Различия, видимые на графике многомерного шкалирования, подтвердились в анализе MaAsLin. В микробиоте условно здоровых более молодых участников исследования в большем количестве были представлены бактерии первых двух энтеротипов — Bacteroides и Prevotella (табл. 3).

Реконструкция метаболических путей в группах

При анализе метаболических путей микробиоты было обнаружено, что один из путей синтеза масляной кислоты через трансформацию ацетилкоэнзима А был выше у долгожителей (adj. р = 0,048; lda = 3,35), тогда как другие пути синтеза бутирата значимо не различались между группами (рис. 3).
В группе долгожителей была также проанализирована ассоциация состава микробиоты и потенциала синтеза различных метаболитов с показателем полноценности питания в пожилом возрасте. В результате обнаружена взаимосвязь с представленностью метаболических путей. Балл по краткой шкале оценки питания оказался ассоциирован с потенциальным синтезом некоторых витаминов группы В, особенно витамина В12. Чем выше был балл, тем выше оказалась потенциальная активность ряда метаболических путей согласно тесту MaAsLin (табл. 4).
Таким образом, в работе были обнаружены ряд особенностей состава микробиоты долгожителей, а также способность микробиоты долгожителей более эффективно производить бутират путем трансформации ацетилкоэнзима А.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сегодня никто не станет отрицать, что микроорганизмы играют огромную роль в нашей жизни. Однако мы крайне мало знаем о населяющих нас жителях. Большинство известных микроорганизмов было обнаружено не так давно благодаря развитию секвенирования нового поколения, и возможные пути их влияния на организм человека остаются малоизученными. Исследования с участием людей, как и представленная работа, по-прежнему достаточно немногочисленны, и чаще являются одномоментными. Тем не менее обнаружение специфических особенностей микробиоты представителей успешного долголетия может помочь в последующей профилактике состояний, ассоциированных с микробиотой кишечника, в том числе и возрастных изменений. Основным результатом данного исследования стало описание микробиоты кишечника долгожителей, состав которой оказался более чем благополучным для столь преклонного возраста. Так, большинство работ, изучающих старение микробиоты, демонстрируют увеличение с возрастом количества условных патогенов и снижение полезных бактерий в кишечнике пожилых людей [4]. Но эта закономерность не подтверждена в группах благополучного старения.

До настоящего времени подобные исследования проводили за рубежом. Так, в одной из работ был зафиксирован более высокий уровень Bifidobacterium в группе долгожителей старше 105 лет по сравнению с людьми среднего возраста, однако этот тренд наблюдали именно в этой группе сверхдолгожителей, но не долгожителей более молодого возраста [6]. Примечательно, что, по данным той же работы, представленность таких полезных для человека бактерий, как Akkermansia и Christensenellaceae, также была выше у долгожителей. Эти результаты привели авторов к выводу, что сохранение здоровой микробиоты может вносить вклад и в долголетие участников исследования.

В составе микробиоты долгожителей были мало представлены патогены и условные патогены — разницы с более молодой когортой по таким бактериям выявлено не было. Более того, уровень бактерий, чрезмерная представленность которых может иметь негативное влияние, таких как Bacteroides и филума Bacteroidetes, был достоверно ниже в микробиоте долгожителей. Например, в исследовании японских авторов подобной зависимости обнаружено не было [7], и уровень выше упомянутых бактерий возрастал в группе глубоко пожилых лиц.

Микробиота кишечника изучаемой когорты долгожителей оказалась благополучной не только по своему составу. На доступном сегодня уровне реконструкции метаболизма были зафиксированы возможные механизмы влияния микробиоты на скорость старения изучаемой группы. Научно привлекательным представляется обнаружение более высокого потенциала синтеза бутирата среди долгожителей. Масляная кислота является противовоспалительным агентом [14, 15], и сохранение ее синтеза микробиотой может обусловливать замедленные темпы старения у долгожителей. В недавнем эксперименте введение мышам бутирата сопровождалось повышением плейотропного фактора роста фибробластов 21, что коррелировало с активацией AMPK и SIRT-1 и снижением активности сигнального пути mTOR [16], т. е. имело в некотором роде «омолаживающий эффект». Продолжение экспериментальных работ позволит сделать более конкретные выводы и установить причинно- следственные связи, но и к настоящему времени можно предположить, что в данной находке имеют отражение основные тенденции здорового старения. При этом выявление высокой метаболической активности микробиоты, проявляющейся в синтезе витаминов, у долгожителей, получивших высокие баллы по краткой шкале оценки питания, стоит интерпретировать с осторожностью. Несмотря на то что были обнаружены транспортеры витаминов в толстой кишке [17], все еще не до конца ясно, насколько принципиален для поддержания уровня витаминов в крови их синтез микробиотой кишечника.

ВЫВОДЫ

Благодаря высокопроизводительному секвенированию мы имеем возможность многое узнать о состоянии «внутреннего мира» человека. По результатам настоящей работы было показано сохранение нормального профиля микробиоты у долгожителей 97 лет и старше. Поддержание уровней симбиотических бактерий и высокого потенциала синтеза масляной кислоты может вносить вклад в сохранение здоровья долгожителей за счет поддержания нормального соотношения про- и противовоспалительного потенциала микробиоты кишечника.