DOI: 10.24075/vrgmu.2017-06-12

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Временная динамика цитокинов в крови при экспериментальном аутоиммунном энцефаломиелите у крыс

Н. В. Позднякова1, В. И. Туробов2, Е. Е. Гаранина3, О. А. Рябая1, Ю. К. Бирюкова4, Н. И. Минкевич2, Е. В. Трубникова5, А. Б. Шевелев6, Т. В. Кузнецова7, А. В. Белякова4, И. П. Удовиченко2,8
Информация об авторах

1 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н. Н. Блохина, Москва

2 Филиал Института биоорганической химии имени академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, Пущино

3 Казанский (Приволжский) федеральный университет, Казань

4 Федеральный научный центр исследований и разработки иммунобиологических препаратов имени М. П. Чумакова РАН, Москва

5 Курский государственный университет, Курск

6 Институт биохимической физики имени Н. М. Эмануэля РАН, Москва

7 Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, Москва

8 Пущинский государственный естественнонаучный институт, Пущино

Для корреспонденции: Удовиченко Игорь Петрович
Пр-т Науки, д. 6, г. Пущино, Московская обл., 142290; ur.xednay@1oknehcivodui

Информация о статье

Финансирование: исследование поддержано Министерством образования и науки Российской Федерации (Соглашение о предоставлении субсидии № 14.607.21.0133 от 27.10.2015, уникальный идентификатор RFMEFI60715X0133).

Благодарности: авторы благодарят Бориса Шевелева за участие в иммунизации животных.

Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений.

Статья получена: 15.12.2017 Статья принята к печати: 20.12.2017
|

Рассеянный склероз (РС) представляет собой тяжелое нейродегенеративное заболевание аутоиммунной природы. Актуальность борьбы с ним обусловлена высокой частотой встречаемости, а также тяжестью течения, приводящей к частичной или полной потере подвижности. Большинство пациентов с РС полностью утрачивают подвижность через 25 лет после появления первых симптомов заболевания. Более половины пациентов с РС через 15 лет после начала болезни могут передвигаться только на костылях. До настоящего времени для лечения этой болезни не предложено эффективного этиотропного средства.

Заболевание возникает, как правило, у достаточно молодых людей: у 70–80 % пациентов первые симптомы РС проявляются в возрасте от 20 до 40 лет [1]. Диагностика РС основана на клиническом осмотре невропатологом, магнитно-резонансном исследовании (МРТ) центральной нервной системы, гистологическом анализе материалов биопсии и аутопсии [2]. Болезнь имеет множество различающихся клинических проявлений, затрагивающих функции спинного и головного мозга, черепных нервов, мозжечка, когнитивные функции. При этом не выработано метода клинической диагностики, позволяющего однозначно оценивать тяжесть заболевания. Результаты МРТ, электроэнцефалографии и биохимического анализа пунктатов спинномозговой жидкости, хотя и являются ценными сведениями о состоянии больного, не всегда могут быть интерпретированы однозначно. Многие частные проявления РС могут быть вызваны не связанными с ним причинами: инфекционными заболеваниями, сосудистыми патологиями, аутоиммунными заболеваниями различной природы [3].

Выделяют четыре формы РС: возвратно-ремиттирующую (приступообразную), RRMS — 80–85 % случаев; первичную прогрессирующую, PPMS — 10–15 % случаев; возвратно-прогрессирующую, PRMS — 5 % случаев; вторично-прогрессирующую, SPMS [4, 5]. Около половины пациентов с RRMS приобретают симптомы SPMS через 10 лет после начала заболевания. Свыше 90 % пациентов с RRMS в конечном итоге приобретают симптоматику SPMS [6].

Основным патогностическим признаком РС является демиелинизация оболочек нейронов ЦНС, вызываемая скоплениями на их поверхности Т- и В-лимфоцитов. Для РС также характерно накопление олигоклональных антител в спинномозговой жидкости. Однако ответа на вопрос, где и как происходит первоначальный запуск клональной экспансии лимфоцитов, специфичных к основному белку миелина MBP, протекает ли этот процесс непосредственно в ЦНС при участии миелиновых оболочек или за пределами ЦНС с последующим накоплением в ней аутореактивных клеточных компонентов, нет [7].

Разработка средств лечения РС требует использования животных моделей, максимально точно воспроизводящих течение заболевания у человека. В качестве такой модели часто используют экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ) у мышей и крыс. Заболевание вызывают введением суспензии миелина или МВР в неполном адъюванте Фрейнда в подушечки лап [8]. В результате паралич задних конечностей инициируется через 1 мес. после иммунизации и длится в течение 4–6 мес. [9]. У крыс линии Dark Agouti (DA) ЭАЭ характеризуется существенно более быстрой динамикой. Паралич конечностей проявляется на 10–11 сутки и заканчивается на 14 сутки. Наиболее значимым отличием ЭАЭ у мышей от РС у человека является полное клиническое излечение иммунизированных животных, недостижимое на сегодня для пациентов с РС.

В работе [10] приведены данные исследования цитокинового профиля у 19 пациентов с РС, в том числе у 16 — с возвратно-ремиттирующей формой, у 1 — c первично-прогрессирующей и у 2 — с вторично-прогрессирующей формой, в зависимости от длительности заболевания: группа 1 — 4,2 ± 0,8 мес. и группа 2 — 76,6 ± 14,3 мес. с момента постановки первичного диагноза. В работе было показано, что на ранней стадии РС в сравнении с поздней стадией и данными для контрольной группы (люди без РС) в структуре цитокинов преобладают интерферон гамма (IFNγ) и антивоспалительный лимфокин IL-10. На поздней стадии снижается содержание IL-1RA, IL-8, IL-12(p70), CCL-3, CCL-7, CCL-11, CXCL-10, FGF, IFNα, а значительная представленность характерна для IL-1a, IL-1b, IL-2RA, IL-3, IL-4, IL-7, IL-12(p40), IL-18, CCL-5 (RANTES), CCL-27, HGF, MIF, M-CSF и TRAIL. Особое внимание авторы обратили на повышение содержания в крови больных РС IL-17, известного в качестве ключевого фактора развития псориатических повреждений кожи [11], а также IL-22 — у пациентов с RRMS. При анализе динамики цитокинов в спинномозго- вой жидкости пациентов авторы [10] пришли к выводу о ключевой роли накопления в ней IFNγ и MIF (ключевоого фактора дегенарации суставной сумки при артрозе), а также факторов миграции лимфоцитов, индуцируемых ими: CCL-5 (RANTES), CCL-2 и CCL-27. Для спинномозговой жидкости, но не крови пациентов с РС оказалось характерным накопление проапоптотических факторов TNF-α и TRAIL.

Анализируя эти данные, можно сделать вывод о том, что для РС характерно длительное системное повышение активности факторов гемопоэза, особенно направленных на гранулоцитарный компонент, длительное поддержание Th1-ответа, избыток факторов миграции лимфоцитов и моноцитов при отсутствии выраженной провоспалительной реакции в виде факторов, стимулирующих продукцию и таксис нейтрофилов. Результаты исследования [10] важны для понимания динамики содержания различных цитокинов в крови и спинномозговой жидкости пациентов с РС, но в силу ограничений статистических методов значимость выявленных закономерностей остается под вопросом.

С учетом изложенного в рамках работы мы решали две задачи:

  1. исследовать краткосрочную динамику цитокинов в модели ЭАЭ у крыс, для которой характерна высокая скорость патологического процесса;
  2. сопоставить данные о содержании цитокинов при РС у человека и ЭАЭ у крыс с целью оценить пригодность этой модели для тестирования кандидатных средств для терапии РС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Индукция ЭАЭ у крыс

Эксперименты на лабораторных животных были проведены в соответствии с «Правилами работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 № 755) и с соблюдением принципов, изложенных в Хельсинкской декларации (2013).

Гомогенат спинного мозга беспородных крыс готовили по методике [12]. Далее использовали крыс линии Dark Agouti массой 220–250 г. В экспериментальную группу включили 11 животных, которым в день 0 вводили в подушечки каждой из двух задних лап заранее приготовленный гомогенат спинного мозга, смешанный с неполным адъювантом Фрейнда в пропорции 1 : 1, общим объемом 100 мкл в каждую лапу. Животным контрольной группы (n = 7) вводили 100 мкл физиологического раствора, смешанного с неполным адъювантом Фрейнда также в пропорции 1 : 1. С 1 по 7 сутки (за исключением 6-х суток) эксперимента у крыс ежедневно отбирали по 500 мкл крови из хвостовой вены. Из отобранной крови немедленно готовили сыворотку по следующей методике: кровь помещали в вакуумные пробирки Vacuette Z serum sepclot activator (для сыворотки) и центрифугировали в течение 15–20 мин при 2500 об./мин и температуре +4 °С. Сыворотку (около 100 мкл) переносили в микроцентрифужные пробирки и замораживали при –20 °С. Крыс ежедневно взвешивали и фиксировали в баллах индекс тяжести клинических проявлений ЭАЭ по следующей шкале: 0 — нет симптомов, 1 — снижение тонуса хвоста, 2 — нарушение установочного рефлекса, 3 — частичный паралич, 4 — полный паралич, 5 — животные погибли или умирают. В сомнительных случаях индекс фиксировали с занижением. Явные признаки ЭАЭ у животных контрольной группы фиксировали с 8 по 14 день с начала эксперимента. Пик заболевания длился 2–3 дня и приходился на 11–14 сутки с начала эксперимента.

Мультиплексный цитокиновый тест

Анализ выполнялся на платформе Bio-Plex (Bio-Rad, США) с помощью набора реагентов Bio-Plex Pro Rat Cytokine 24-plex Assay (Bio-Rad), работа которого основана на использовании магнитных частиц с нанесенными моноклональными антителами к цитокинам крысы, согласно инструкции производителя и в соответствии с ранее опуб- ликованным протоколом [13]. Для анализа использовали аликвоты сыворотки объемом 50 мкл. Среднюю интенсивность флуоресценции каждого образца определяли на приборе Luminex 200 analyzer (Luminex Corporation, США). Для сбора данных использовали программное обеспечение MasterPlex CT и MasterPlex QT analysis software (Hitachi Solutions America, США). Для каждого аналита строили калибровочный график с использованием 7 концентраций, выражая ее в пг/мл сыворотки.

Статистическая обработка данных

Для экспериментальной и контрольной групп для каждого цитокина на каждые сутки эксперимента вычисляли медианное значение содержания для группы и два квартильных значения. После этого проводили сопоставление достоверности различий между группами с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни, используя пакет программ Statistica 8.0 для Windows. При p-value > 0,05 различия были недостоверны; также использовали три по- рога достоверности: первый — ≤ 0,05; второй — ≤ 0,01; третий — ≤ 0,001.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящее время сведений о краткосрочной динамике цитокинов в крови человека и лабораторных животных все еще недостаточно, т. к. мультиплексные тесты дороги, а ежедневный отбор крови у больных и животных сопряжен с техническими и этическими трудностями. Анализ динамики содержания цитокинов в контрольной группе показал, что введение неполного адъюванта Фрейнда в подушечки лап само по себе является фактором, вызывающим значительные волнообразные колебания уровня цитокинов в крови, хотя и не приводит к развитию ЭАЭ. Это обстоятельство снижает достоверность оценки влияния гомогената спинного мозга на развитие экспериментального заболевания и требует использования статистических методов анализа динамики содержания цитокинов.

У всех животных экспериментальной группы наблюдали паралич задних конечностей. Восходящая фаза заболевания пришлась на 11–13 сутки, нисходящая — на 12–17 сутки. К 18 суткам симптомы паралича у всех животных полностью исчезали. Таким образом, отбор крови, который производили в 1–7 сутки, осуществляли на стадии, когда внешние проявления ЭАЭ отсутствовали.

Анализ данных (табл. 1 и табл. 2), показал, что в первые сутки эксперимента содержание 13 из 24 анализируемых цитокинов — IL-1a, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12(p70), IL-17, IL-18, G-CSF, IFN-γ, RANTES (CCL-5) и MCP-1 (CCL-2) — в экспериментальной группе было существенно выше, чем в контрольной, (например, до 220 % — для IL-4) по второму и третьему порогам достоверности (рис. 1). Во вторые сутки ни по одному цитокину достоверных различий не наблюдали. На третьи сутки были выявлены различия для IL-1b и VEGF (≤ 0,05), но на четвертые сутки вновь ни для одного цитокина достоверных различий не было. На пятые сутки эксперимента в экспериментальной группе достоверно снизилось содержание IL-1a, IL-1b, IL-13 и эритропоэтина (рис. 2).

На седьмые сутки различия между группами были выявлены по 14 цитокинам из 24 исследованных. Это были практически все те же цитокины, различия по которым наблюдали в первые сутки эксперимента, с тем отличием, что были зафиксированы статистически значимые изменения по IL-10 и эритропоэтину GM-CSF и не были зафиксированы — по IL-12(p70) и G-CSF (рис. 3). Необходимо отметить, что содержание 13 из 14 цитокинов в экспериментальной группе оказалось выше, чем в контрольной. Исключение составил только GM-CSF, содержание которого снизилось с 8,17 пг/мл до 2,00 пг/мл.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Резкий рост содержания различных цитокинов в первые сутки эксперимента с последующим падением во вторые сутки следует интерпретировать как острый клонально-неспецифичный ответ на появление избытка миелина вне ЦНС. Вероятно, реакция на миелин в виде одновременного выброса нескольких лимфопролиферативных факторов стимулируется гиперпродукцией IL-1b, источником которого являются макрофаги, дендритные клетки или фибробласты кожи.

Рост уровня продукции цитокинов на пятые и особенно седьмые сутки эксперимента, скорее всего, можно объяснить накоплением в организме животных клонально-специфичных лимфоцитов различных типов, среди которых могут быть лимфоциты с аутологичной реактивностью в отношении миелина. Для системной клональной экспансии Т-лимфоцитов характерна именно такая длительность реакции, после чего возникают внешние проявления физиологической реакции.

Наиболее значимые в абсолютном выражении различия между экспериментальной и контрольной группами на седьмые сутки эксперимента были выявлены для IL-18 — 2475,85/4182,05 пг/мл, RANTES — 756,78/1310,78 пг/мл, МCP-1 (CCL-2) — 1909,68/3300,50 пг/мл и IL-2 — 743,52/1091,57 пг/мл. С учетом того, что для IL-2 доказана способность индуцировать продукцию многих других ростовых и гемопоэтических факторов [14], можно предположить, что именно этот лимфокин является индуктором таких неспецифических для иммунной системы факторов, как VEGF и эритропоэтин, а также IL-13, всплеск продукции которых запаздывал по фазе относительно IL-2. С учетом длительной персистенции высоких уровней продукции IL-2, по данным [10], характерной для пациентов с РС, можно предположить главную роль этого лимфокина в характерной для РС массовой пролиферации лимфоцитов за пределами ЦНС. Повышение уровня продукции IL-4, IL-5, IL-6, IL-7 и IL-13, также представляющих собой лимфопролиферативные и гепомоэтические факторы, на фоне падения уровня продукции GM-CSF, можно рассматривать в качестве каскада, индуцированного при участии IL-2.

Для ЭАЭ у крыс в отличие от РС у человека не характерна продукция проапоптотических факторов, прежде всего TNFα, несмотря на подъем уровня синтеза его классических индукторов — цитокинов IL12, IL-18 и IFN-γ [14]. Таким образом, рост содержания TNFα при РС следует рассматривать скорее в качестве результата, а не причины поражения миелиновых оболочек. В то же время TNFα может вносить существенный вклад в поражение астроцитов и нейронов на поздних стадиях развития РС.

В соответствии с описанной в работе [10] закономерностью, наблюдавшиеся нами подъем и спад продукции IFN-γ и RANTES (CCL-5) у крыс с ЭАЭ, происходившие синхронно, следует рассматривать как процессы, характерные и для РС у человека.

На ранней стадии развития ЭАЭ у крыс нами не было выявлено изменение уровня накопления в крови GRO/KC (CXCL1), ответственного за инфильтрацию лимфоцитов в ЦНС, что отличает модель от течения РС у человека (по данным [10]).

Для ЭАЭ у крыс и РС у человека в равной мере характерна гиперпродукция IL-17, которая может способствовать накоплению специфических лимфоцитов в ЦНС и активации у них цитотоксических функций.

Несмотря на выраженную гиперпродукцию IL-1b, для РС у человека характерно отсутствие участия в патогенетических реакциях нейтрофилов и факторов их таксиса и активации. В случае с моделью наблюдали похожую реакцию системы нейтрофилов. Фактор пролиферации предшественников нейтрофилов M-CSF не изменял своего содержания в процессе моделирования. То же наблюдали для MIP-3a (CCL20) — фактора защиты слизистых от бактериальной инфекции и лептина, отвечающего за повышение температуры при инфекции.

Гиперпродукцию IL-4 и IL-10 при ЭАЭ у крыс, особенно на фоне повышенного содержания IL-5, IL-13 и GM-CSF, следует рассматривать в качестве фактора, стимулирующего пролиферацию В-лимфоцитов. Теоретически этот набор факторов может способствовать появлению олигоклональных антител, однако такой факт до настоящего времени никем не был описан.

Отвечая на вопрос о локализации очага пролиферации миелин-специфичных лимфоцитов — внутри или вне ЦНС, необходимо отметить, что выбранная модель демонстрирует принципиальную возможность запуска этой реакции вне ЦНС. Однако динамика развития заболевания при ЭАЭ у крыс и РС у человека значительно различается. Нельзя исключать, что при развитии РС у человека первым событием является инфильтрация в ЦНС лимфоцитов, не прошедших клональную экспансию, которые затем подвергаются селекции в условиях избытка миелина. На аномальное поведение лимфоцитов в модели может влиять их первоначальная клонально-неспецифическая гиперпролиферация под действием системного или местного избытка лимфопролиферативных факторов и/или возникновение градиента лимфотактических факторов, исходящего из ЦНС. Альтернативой может быть инициация аномально быстрой деградации миелина в ЦНС, приводящая к массовому выходу продуктов его распада в системную циркуляцию. В этом случае модель является наиболее адекватной ранним стадиям РС у человека.

ВЫВОДЫ

Данные о динамике содержания цитокинов при ЭАЭ у крыс, полученные с помощью мультиплексного цитокинового теста, показали, что с точки зрения цитокинового профиля модель соответствует течению рассеянного склероза у человека в части динамики содержания системных лимфопролиферативных и гемопоэтических факторов: IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-7. В отношении факторов таксиса лимфоцитов, моноцитов и других клеток иммунной системы модель удовлетворительно имитирует поведение IL-17, RANTES (CCL-5) и MCP-1 (CCL-2), но отличается по поведению GRO/KC (CXCL1). Применительно к факторам, влияющим на цитотоксические и апоптотические реакции, модель схожа с течением РС у человека по таким ключевым факторам, как IFNγ, IL-6 и IL-17, но не по TNFα.

КОММЕНТАРИИ (0)