Род Aerococcus был впервые описан в 1953 г., первым его изученным представителем стал Aerococcus viridans, выделяемый из воздуха и уличной пыли [1]. В настоящее время известно восемь видов, входящих в род Aerococcus: A. viridians, A. urinae, A. sanguinicola, A. christensenii, A. urinaehominis, A. urinaeequi, A. suis, A. vaginalis [2].

Представители рода Aerococcus чаще связаны с инфекцией мочевыводящих путей и уросепсисом [3]. Вместе с тем, в последнее десятилетие появилось много сообщений о случаях осложнений, вызываемых бактериями этого рода, в виде инфекции кровотока и инфекционного эндокардита, при которых A. urinae и A. sanguinicola считают наиболее частой этиологической причиной [2, 3]. Кроме того, было показано, что аэрококки этого рода способны вызывать инвазивные инфекции — остеомиелит, менингит, септический артрит, перитонит, инфекции мягких тканей, этиологию которых чаще связывают с выделением Aerococcus-подобных микроорганизмов и A. urinae [2]. В Дании с 1987 г. описано 17 случаев бактериемии/септицемии, вызванных Aerococcus-подобными микроорганизмами с выделением в чистой культуре из крови, из которых в шести случаях был эндокардит, и у остальных больных — септицемия, несмотря на адекватную антимикробную терапию у семи пациентов произошел летальный исход [4]. По данным других авторов, выделение Aerococcus в гемокультуре расценивали как этиологический фактор бактериемии при заболеваниях мочевыделительной системы [5].

Вирулентность видов Aerococcus связывают со способностью этих микроорганизмов к образованию биопленок (в том числе in vivo на клапанах сердца), агрегации тромбоцитов, бактериальной адгезии с помощью капсульного полисахарида, наличие которого было подтверждено сравнительным геномным анализом, показавшим широкое внутривидовое разнообразие локусов, ответственных за его синтез у представителей этого рода [2, 6, 7].

Целью работы было представить характеристику штамма Aerococcus sp. 1KP-2016, выделенного из крови пациента с инфекцией кровотока.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культивирование штамма Aerococcus sp. 1KP-2016 проводили на Columbia Agar Base (Conda; Испания) с добавлением 10% бараньей крови в течение 24–48 ч при температуре 37 ± 1 °С в микроаэрофильных условиях. Культуральноморфологические свойства выросших колоний оценивали с помощью стереоскопического микроскопа SteREO Discovery V12 (Carl Zeiss; Германия) (объектив PlanApo S 1,0 — FWD 60 мм; окуляр PI 10 x 23 Br foc). Тинкториальные свойства изучали путем окраски по Граму (ЗАО «ЭКОлаб»; Россия). Окрашенные мазки просматривали с помощью светового микроскопа Axio Scope А1 (объектив EC Plan-NEOFLUAR 100 × 1,3; окуляр PI 10 × 23 Br foc (Carl Zeiss; Германия)). Биохимические свойства бактерий были изучены с помощью коммерческой биохимической тест-системы Микро-ЛА-Тест CТРЕПТОтест 16 (Лахема; Чехия) и лабораторно приготовленного теста на каталазу.

Антибиотикочувствительность изучали с помощью диско-диффузионного метода в соответствии с рекомендациями Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST) с использованием коммерческих стандартизованных бумажных дисков (HiMedia Laboratories Pvt. Limited; Индия).

Разрушение клеток для высвобождения хромосомной ДНК производили путем кипячения. Амплификацию фрагмента гена 16S рРНК осуществляли согласно общепринятому протоколу [8]. Реакционная смесь для ПЦР содержала 1,5 мМ MgCl₂, 10 мМ Tris-HCl (pH 8,3), 50 мМ KCl, 0,1 мкМ праймеров — 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и 1492R (5'-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'), 200 мМ каждого нуклеозидтрифосфата и 1 ед. Taq ДНК-полимеразы (Thermo Fisher Scientific; Литва). Амплификацию проводили с 1 мкл препарата ДНК в общем объеме реакционной смеси 25 мкл с использованием амплификатора «Терцик» («ДНК-Технология»; Россия). Очистку ПЦР-продуктов и их секвенирование проводили на базе ЗАО «Евроген» (Москва, Россия) (http://evrogen.ru/). Результаты секвенирования обрабатывали с помощью программного обеспечения ChromasLite (Technelysium Pty Ltd, Австралия) (для формата хроматограммы), секвенированные последовательности сопоставляли с международной онлайн-базой данных EMBL/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) c помощью алгоритма megablast.

Секвенирование генома штамма Aerococcus sp. 1KP-2016 было выполнено на базе ФБУН МНИИЭМ им. Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора с помощью системы Ion Proton (Thermo Fisher Scientific; США). Сборка генома de novo была сделана с помощью программного обеспечения SPAdes [9].  Проверка на контаминацию сборки проведена с помощью Contest16S [10] и CheckM [11]. Для поиска систем CRISPR-Cas использовали CRISPRCasFinder [12], интегрированных фаговых геномов — PHASTER [13], генов антибиотикорезистентности — ResFinder [14].

Для сравнительного анализа были использованы все публично доступные геномы рода Aerococcus из базы данных Refseq на момент 4 октября 2021 г., а также Abiotrophia defectiva ATCC 49176T в качестве внешнего представителя (outgroup). Белок-кодирующие области в геномах, в соответствии с представленными в базах данных аннотациями, были кластеризованы в группы ортологов с использованием программного обеспечения ProteinOrtho [15] со стандартными настройками. В результате была получена консервативная часть протеома из 543 групп ортологов, включающих в себя по одному однокопийному белок-кодирующему гену из каждого генома. Аминокислотные последовательности белков в данных группах ортологов были выровнены с помощью MUSCLE [16] и конкатенатированы. Филогенетическая реконструкция на основании полученного конкатената выполнена с помощью алгоритма RapidNJ [17]. Среднюю нуклеотидную идентичность между геномами рассчитывали с помощью подхода ANIb и онлайн-сервиса JSpeciesWS [18]. Данные по средней нуклеотидной идентичности представлены двумя значениями через черту, чтобы отобразить различия между картированием фрагментов первого генома на второй и второго на первый соответственно. База данных GTDB, содержащая в себе альтернативную таксономию на основании исключительно филогеномного подхода [19], на момент написания статьи была представлена релизом 202.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штамм Aerococcus sp. 1KP-2016 был выделен из лейкоцитарного слоя крови пациента с инфекцией кровотока (36 лет, г. Ставрополь) в августе 2016 г., у которого на протяжении длительного времени (в течение года) отмечалась субфебрильная температура.

На колумбийском агаре через 24–48 ч формировались единичные мелкие гладкие колонии размером менее 1 мм с неровными краями, приподнятым центром, полупрозрачные серовато-белого цвета с небольшой зоной гемолиза (рис. 1). В мазке, окрашенном по Граму, были выявлены грамположительные кокки, образующие тетрады (рис. 2). При оценке биохимических свойств выделенная культура дала положительные результаты на галактозидазу, эскулин, лактозу, трегалозу, и отрицательные на каталазу, гиппурат, фосфатазу, лейцин, альфа-аргинин, уреазу, маннитол, сорбитол, раффинозу, инулин, мелибиозу, рибозу. Культура была резистентна к ципрофлоксацину, офлоксацину, пенициллину, эритромицину, доксициклину, сохраняла промежуточную резистентность к клиндамицину и чувствительность только к имипенему.

Геном штамма Aerococcus sp. 1KP-2016, собранный до уровня контигов, был депонирован в DBJ/EMBL/GenBank под идентификатором NEEY00000000, впоследствии он вошел в NCBI Refseq как NZ_NEEY00000000. В результате сборки получено 119 контигов со средним покрытием 78x, суммарная длина полученной геномной последовательности составила 2,042 млн п.н. GCсостав достигал 38,5%. Алгоритм Contest16S не выявил различающихся фрагментов гена 16S рРНК, свидетельствующих о контаминации. Анализ набора консервативных генов с помощью CheckM показал оценку полноты генома 98,9% и оценку контаминации 1,1%, что соответствует высокому качеству сборки. В геноме не обнаружено локусов CRISPR. По данным PHASTER, геном имеет два предполагаемых профага в своем составе, в одном из которых присутствуют неповрежденные гены главного капсидного белка (B9P78_00230), белка хвоста (B9P78_00200) фаговой терминазы (B9P78_00240) и праймазы (B9P78_00325), что указывает на его интактность. Несмотря на низкую чувствительность штамма к антибактериальным препаратам, в результате поиска генов резистентности к антибиотикам был обнаружен только ген, кодирующий хлорамфениколО-ацетилтрансферазу (B9P78_09255). Регион в начале контига NEEY01000023 кодирует ряд ферментов биосинтеза полисахаридов (B9P78_05530-B9P78_05565), входящих в состав клеточной стенки или капсулы.

Последовательность 16S рРНК штамма Aerococcus sp. 1KP-2016 была на 98,7% и 98,6% идентична последовательностям типовых штаммов A. viridans и A. urinaeequi соответственно. В настоящий момент для дифференциации бактериальных видов принят порог в  98,7% [20] и, таким образом, схожесть 16S рРНК в данном случае не позволяет однозначно судить о таксономическом положении. В то же время средняя нуклеотидная идентичность между просеквенированной геномной последовательностью и геномами типовых штаммов A. viridans ATCC 11563 и A. urinaeequi DSM 20341 составлет 77,38/77,39% и 76,49/76,26% соответственно. Это значительно ниже, чем общепринятый порог в 95–96% для отнесения бактерий к одному виду [20, 21], что говорит о необходимости введения нового вида. Полученный результат дополнительно подтверждается базой данных альтернативной, построенной на сравнении геномов таксономии GTDB, в которой штамм 1KP-2016 отнесен к отдельному виду Aerococcus sp002252085.

На основании реконструкции филогении (рис. 3) показано, что наиболее родственным к штамму Aerococcus sp. 1KP-2016 является штамм Aerococcus sp. SJQ22 (RKMG01000000), выделенный из почвы и на данный момент не отнесенный ни к одному валидированному виду рода Aerococcus. Однако средняя нуклеотидная идентичность между Aerococcus sp. 1KP-2016 и этим штаммом составила всего лишь 87,87/88,05%, что опять же ниже общепринятого уровня сходства внутри вида.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Aerococcus являются причиной спорадических заболеваний мочевого тракта, эндокардита, инфекций ликвора и кровотока. Наиболее часто выделяют A. urinae (55–60%), A. sanguinicola (26–46%) и реже — A. viridians. В Европе и США превалирует A. sanguinicola и редко — A. viridians. Aerococcus рассматривают как часть нормальной микробиоты урогенитального тракта и выделяют из мочи при отсутствии клинических симптомов заболевания. Ретроспективное когортное исследование 2010–2015 гг. показало этиологическую роль Aerococcus при инфекциях мочевыводящих путей и бессимптомной бактериурии,  преимущественно у пожилых женщин, при этом в 35% случаев помимо аэрококков были выделены другие микроорганизмы [5, 22]. Ретроспективное когортное исследование 2005–2020 гг. больных с положительной гемокультурой аэрококков показало в 22,4% случаев достоверную клиническую картину наличия инфекции кровотока, где летальность зависела от продолжительности заболевания: при 30-дневной она составляла 17% и при трехмесячной — 24% случаев [2]. При выделении из пробы мочи или крови микробиологам трудно идентифицировать Aerococcus, так как по морфологии эти бактерии часто принимают за стафилококки, по гемолизу — за α-гемолитические стрептококки. Учитывая низкую биохимическую активность, биохимические тесты  не позволяют получить достоверные результаты. В связи с этим видовая идентификация до вида возможна с использованием масс-спектрометрии, однако данная технология позволяет идентифицировать пять видов аэрококков: A. christensenii, А. sanguinicola, А. urinae, А. urinaehominis, А. viridians. Поэтому для идентификации штаммов аэрококков, выделенных из крови, применяют секвенирование гена 16S рРНК [5, 22].

Проведенное исследование позволило впервые идентифицировать штамм Aerococcus sp. 1KP-2016, который выделен из лейкоцитарного слоя крови человека, обладает последовательностью 16S рРНК, совпадающей на 98,7% и менее с ранее описанными представителями данного рода. Проведенное полногеномное секвенирование с последующей филогенетической реконструкцией показало, что данный штамм является представителем нового вида рода Aerococcus, наиболее близкого к A. viridans и A. urinaeequi.

Следовательно, представители Aerococcus остаются микроорганизмами, у которых эпидемиологические и клинические характеристики полностью не изучены. Имеется много фундаментальных вопросов о патогенетической роли аэрококков в инфекционной инвазивной патологии. Сложности видовой идентификации внутри рода Aerococcus требуют применения современных молекулярно-генетических технологий, что позволяет определять новые виды микроорганизмов и расширять этиологический спектр возбудителей тяжелых инвазивных заболеваний.

ВЫВОДЫ

Генотипические особенности изученного штамма позволяют сделать вывод, что выделенный из крови штамм 1KP-2016 является представителем нового вида рода Aerococcus, который эволюционно близок A. viridans и A. urinaeequi, но в то же время отличается от них. Необходимо дальнейшее изучение его фенотипических и хемотаксономических свойств в рамках полифазного подхода к бактериальной систематике.