DOI: 10.24075/vrgmu.2017-06-09

ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Рак молочной железы: анализ спектра соматических драйверных мутаций с применением высокопроизводительного секвенирования

К. Ю. Цуканов1, А. Ю. Красненко1, Д. О. Коростин1, А. В. Чуров2, И. Ф. Стеценко1, Н. А. Плотников1, С. А. Зарубина3, В. А. Белова3, А. В. Ковыршина3, И. К. Воротников4, А. А. Мещеряков4, В. В. Ильинский1,3,5
Информация об авторах

1 ООО «Генотек», Москва

2 Карельский научный центр Российской академии наук, Петрозаводск

3 Институт общей генетики имени Н. И. Вавилова РАН, Москва

4 Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н. Н. Блохина, Москва

5 Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В. Н. Ореховича, Москва

Для корреспонденции: Ильинский Валерий Владимирович
Наставнический пер., д. 17, стр. 1, под. 14, 15, г. Москва, 105120; ur.ketoneg@ofni

Информация о статье

Финансирование: работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ (идентификатор соглашения RFMEFI60716X0152).

Вклад всех авторов в работу равнозначен: подбор и анализ литературы, планирование исследования, сбор, анализ и интерпретация данных, подготовка черновика рукописи, внесение исправлений.

Статья получена: 12.12.2017 Статья принята к печати: 22.12.2017
|

Рак молочной железы (РМЖ) является вторым по распространенности типом рака в мире, занимает первое место в структуре онкологической заболеваемости и второе — в структуре смертности среди женщин [1]. Заболеваемость РМЖ увеличивается с возрастом и особенно велика среди женщин 60–65 лет, при этом патология зачастую диагностируется на поздних стадиях, что и определяет высокий уровень смертности от нее. Наибольшую опасность представляет собой метастазирующий РМЖ, который крайне трудно поддается лечению, несмотря на применение комбинированных схем, включающих химио- и гормонотерапию, а также использование таргетных противоопухолевых препаратов. Общий уровень 5-летней выживаемости пациентов при РМЖ составляет 55 %. В этой связи представляется актуальной разработка подходов для более эффективного скрининга РМЖ и выбора средств для таргетной терапии, учитывающих молекулярно-генетические особенности опухолей.

Стремительное развитие технологий высокопроизводительного секвенирования (next-generation sequencing, NGS) привело к получению большого количества данных о генетических вариантах [2]. Идентифицировано множество мутаций, связанных с развитием РМЖ, в том числе соматические и герминальные мутации в генах PIK3CA, STK11/LKB1, CDH1, ATM, CHEK2, BRIP1, PALB2, а также мутации в высокопенетрантных генах TP53, PTEN, MLH1, BRCA1, BRCA2, ассоциированных с наследственными формами РМЖ [3].

Большинство мутаций, возникающих в опухолях, являются соматическими и играют важную роль в патогенезе онкологических заболеваний и развитии de novo резистентности к лекарственным препаратам. Поэтому многие исследования направлены на профилирование вариантов в образцах опухолей с применением NGS. В результате было идентифицировано значительное количество вариантов с неизвестной функцией. Для их описания необходимы математические алгоритмы, позволяющие обрабатывать большие массивы данных в автоматическом режиме, предсказывать потенциально патогенные мутации и отличать их от нейтральных изменений генома опухолевых клеток. Результаты подобных исследований могут быть использованы для разработки скрининговых и диагностических инструментов (включая технологии жидкостной биопсии), а также инструментов подбора таргетных противоопухолевых препаратов.

В настоящей работе представлены результаты анализа спектра мутаций в составе ключевых онкогенов при РМЖ с применением метода высокопроизводительного секвенирования и ранее разработанного биоинформатического алгоритма для функциональной аннотации мутаций и оценки их патогенности.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Для проведения исследования были получены образцы опухолей от 16 пациенток со злокачественными новообразованиями молочной железы в возрасте от 27 до 76 лет (средний возраст — 50,7 ± 11,3 года), проходивших комплексное обследование и получавших комбинирование лечение в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии имени Н. Н. Блохина (Москва). Критериями включения в исследование были: возраст 18–70 лет, женский пол, наличие гистологически и цитологически подтвержденного диагноза «рак молочной железы». Критериями исключения являлись наличие других форм новообразований в анамнезе и беременность.

Стадию опухолевого процесса устанавливали согласно классификации TNM [4]. В исследование были включены пациентки со стадиями T1–3N0–3M0–1.

Работа была выполнена с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности. От всех пациентов были получены письменные информированные согласия на проведение исследования. Клиническая характеристика больных представлена в табл. 1.

Выделение ДНК и контроль качества

Выделение ДНК из образцов опухолевой ткани проводили с применением набора DNeasy Blood and Tissue Kit (Qiagen, США). Измельченные образцы опухолевой ткани после добавления буфера ATL обрабатывали протеиназой K и инкубировали при 56 °C до полного лизиса. Затем обрабатывали ферментом РНКазой А. Далее последовательно добавляли 200 мкл буфера AL и 96 % этанола. Полученную смесь переносили на спин-колонки и центрифугировали при 8 000 g в течение 1 мин. Затем образцы промывали с применением буферов AW1 и AW2 для удаления солей (гуанидина и SDS). Для элюции ДНК колонки обрабатывали буфером 1x Low-TE (дважды, по 30 мкл), затем инкубировали и центрифугировали согласно протоколу производителя. Контроль качества полученной ДНК проводили на флуориметре Qubit 3.0 (Thermo Fisher Scientific, США), а также с помощью электрофореза в 1 % агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Секвенирование таргетной панели онкогенов

Из образцов ДНК опухолей молочной железы готовили библиотеки с применением набора реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (New England Biolabs, США). Двойное баркодирование библиотек проводили с помощью ПЦР с применением наборов реагентов NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina и NEBNext Multiplex Oligos for Illumina (Dual Index Primers Set 1, New England Biolabs). Контроль качества полученных библиотек фрагментов ДНК проводили на приборе Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, США) с помощью набора реагентов этого же производителя High Sensitivity Kit в соответствии с протоколом производителя.

Для таргетного обогащения кодирующих регионов геномов опухолей использовали набор MYbaits Onconome KL v1.5 Panel (MYcroarray, США). Анализ проводили с применением системы высокопроизводительного секвенирования HiSeq 2500 (Illumina, США) методом парных прочтений длиной 100 нуклеотидов. Подготовку образцов и запуск секвенирования осуществляли согласно стандартным протоколам Illumina.

Биоинформатическая обработка данных

Для биоинформатической обработки полученных при секвенировании NGS-данных применяли ранее разработанный алгоритм [5]. На начальном этапе проводили оценку качества прочтений, полученных при секвенировании ДНК опухолей: последовательности, имевшие качество прочтения ниже 10, удаляли с помощью программного обеспечения Cutadapt [6]. После этого прочтения картировали на референсный геном hg19 (GRCh37.p13) с помощью алгоритма BWA (Burrows–Wheeler Aligner) [7]. ПЦР-дубликаты удаляли специализированной командой rmdup в составе программной платформы SAMtools [8].

Для поиска мутаций применяли инструмент MuTect [9]. В качестве значимых вариантов, рассматривали последовательности ДНК, число покрытий которых в результате секвенирования составило не менее 12.

Для оценки функционального эффекта обнаруженных мутаций проводили их аннотирование и предсказание их влияния на кодируемый белок на основе анализа геномных координат фрагментов с помощью программы SnpEff [10].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

С применением метода высокопроизводительного секвенирования на платформе Illumina мы провели скрининг образцов 16 опухолей молочной железы на наличие мутаций. Среди онкогенов в составе таргетной панели были исследованы BRCA1, BRCA2, ATM, CDH1, CHEK2, MRE11A, NBN, PALB2, PTEN, RAD50, RAD51C, TP53, SEC23B. В результате применения биоинформатического алгоритма для анализа данных были обнаружены 58 точечных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, ATM, CDH1, CHEK2 и TP53, среди них — 19 гомозигот и 39 гетерозигот. Список уникальных мутаций представлен в табл. 2.

На рисунок представлено распределение частот встречаемости мутаций в генах, в которых их было обнаружено больше всего: ATM, TP53 и BRCA1. Наиболее часто встречающиеся мутации — c.376-283T>C (TP53), c.3994-193T>C и c.8010+186C>T (ATM), а также c.5215+66G>A (BRCA1).

Среди обнаруженных нами генетических вариантов по результатам биоинформатической обработки данных и аннотирования мутаций с применением баз данных были отобраны мутации с потенциально значимым влиянием на регуляторную или белковую последовательность. Для оценки патогенности и консервативности выявляемых генетических вариантов использовали данные, которые извлекали из таких источников, как COSMIC (Catalogue of Somatic Mutations In Cancer) [11] и dbNSFP [12]. Дополнительно для предсказания патогенности обнаруженных вариантов, оценки их эффекта на функцию кодируемого белка применяли утилиты SIFT (Sorting Intolerant From Tolerant) и PolyPhen2 [13, 14]. Информацию о частоте мутаций получали на основе данных проекта 1000 Genomes и консорциума ExAC [15, 16].

Всего в результате проведенного анализа отобрали 14 мутаций, влияющих на белковую последовательность: BRCA2 — c.4828G>A (p.Val1610Met), c.5070A>C (p.Lys1690Asn); TP53 — c.524G>A (p.Arg175His), c.469G>T (p.Val157Phe); CHEK2 — c.1289C>T (p.Thr430Ile); ATM — c.146C>G (p.Ser49Cys), c.4258C>T (p.Leu1420Phe), c.1192G>C (p.Asp398His); CDH1 — c.790C>T (p.Gln264), c.1342C>T (p.Gln448); BRCA1 — c.1865C>T (p.Ala622Val), c.384G>A (p.Met128Ile), c.54G>T (p.Met18Ile).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для детекции известных мутаций в генах, связанных с риском развития РМЖ, в России получили наибольшее распространение методы, основанные на полимеразной цепной реакции. Однако на современном этапе развития методов генетической диагностики одной из наиболее перспективных технологий выявления генетических вариантов в клетках злокачественных опухолей является высо- копроизводительное секвенирование. При этом наиболее актуально его применение для изучения вариабельности исследуемых участков геномов опухолей, характеризуемых высокой генетической гетерогенностью. В данной работе нами был исследован методом высокопроизводительного секвенирования спектр мутаций ключевых онкогенов при РМЖ и проведено тестирование разработанного ранее алгоритма для биоинфоматической обработки NGS-данных.

Одним из наиболее детально изученных генов, играющих важную роль в патогенезе РМЖ, является TP53, регулирующий клеточный цикл, процессы апоптоза и репарации ДНК. Мутации в этом гене приводят к нарушению вышеуказанных процессов и способствуют развитию злокачественных новообразований. TP53 представляет собой онкосупрессор, мутации в нем обнаруживаются примерно в половине всех случаев онкологических заболеваний и более чем в 30 % случаев РМЖ. Что касается спорадического РМЖ, то при нем частота мутаций в гене TP53 варьирует от 25 до 86 % — в зависимости от стадии опухолевого процесса и методов детекции. Прогностическая значимость мутаций в TP53 при РМЖ была подробно изучена [17]. Среди мутаций, выявленных нами, чаще всего встречалась мутация c.376-283T>C: у 13 из 16 пациенток (81 %).

При РМЖ отмечена относительно высокая частота возникновения мутаций в генах BRCA1 и BRCA2, в особенности для некоторых форм РМЖ. Эти гены участвуют в регуляции многих клеточных процессов, обеспечивая прежде всего поддержание стабильности генома, гомологичную рекомбинацию при репарации разрывов двуцепочечной ДНК. Мутации в этих генах часто приводят к нарушению нормального протекания вышеуказанных процессов и являются этиологическим фактором развития наследственного РМЖ, значительно увеличивают индивидуальный риск развития рака. Примерно четверть всех случаев наследственного РМЖ ассоциирована с мутациями в BRCA1/2 [17].

В России распространены мутации в BRCA1, составляющие порядка 80 % всех мутаций в этих двух генах при РМЖ. К примеру, одной из наиболее часто встречающихся является мутация 5382insC (rs80357906), приводящая к сдвигу рамки считывания и потере функции кодируемым белком. Значительную долю обнаруженных нами вариантов также составили мутации в генах BRCA1 и BRCA2, при этом чаще всего встречалась мутация c.5215+66G>A (rs3092994) в гене BRCA1, обнаруженная у 9 из 16 пациенток (52,9 %).

Результаты общего анализа спектра мутаций в генах ATM, TP53 и BRCA1 в целом согласуются с данными литературы, в соответствии с которыми при РМЖ к наиболее часто встречающимся мутациям относятся изменения в гене TP53 [17]. Сопоставимы с известными данными и результаты оценки разнообразия генетических вариантов в генах BRCA1/2. Важно, что мутации в этих генах ассоциированы с неблагоприятным прогнозом и развитием инфильтративного протокового РМЖ. Наличие таких мутаций также учитывается при оценке объема хирургического вмешательства [17]. По нашим данным, из 12 пациенток с РМЖ и мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 у 8 был диагностирован именно инфильтративный протоковый РМЖ. При этом наиболее часто (у 6 пациенток из 8) встречалась мутация c.5215+66G>A (BRCA1).

В результате биоинформатического анализа данных, полученных в ходе высокопроизводительного секвенирования, нами было обнаружено множество мутаций-драйверов в образцах злокачественных опухолей молочной железы. С применением различных баз данных были отобраны и аннотированы мутации со значимым функциональным эффектом. Всего нами было обнаружено 14 патогенных мутаций, оказывающих влияние на аминокислотную последовательность кодируемых белков. В каждом из исследованных образцов была обнаружена минимум одна такая мутация. Разработанный нами протокол для биоинформатического анализа NGS-данных позволяет обрабатывать их в автоматическом режиме.

ВЫВОДЫ

Высокопроизводительное секвенирование в комбинации с современными алгоритмами для биоинформатической обработки данных позволяет проводить поиск генетических вариантов и оценку функционального эффекта выявляемых мутаций в опухолях, что представляет интерес для применения данных технологий в медицинских целях. На сегодняшний день уровень развития методов NGS позволяет проводить молекулярную классификацию опухолей при РМЖ, определять подтипы опухолей в зависимости от спектра выявляемых мутаций и профиля экспрессии генов, подбирать на основе этих данных наиболее подходящие противоопухолевые препараты. Одной из главных текущих задач в сфере онкогенетики является поиск и разработка инструментов для идентификации биомаркеров РМЖ, удобных для клиницистов при постановке диагноза и назначении адекватной терапии. Следующим этапом в развитии данной области исследований должно стать совершенствование биоинформатических подходов, переход к системам автоматического анализа генетического профиля опухолей и внедрение технологий NGS в клиническую практику.

КОММЕНТАРИИ (0)