Очаговая склеродермия (ОСД) — хроническое заболевание соединительной ткани, главным образом поражающее кожу и подлежащие ткани, характеризующееся появлением локальных очагов склероза на фоне воспалительных процессов (эритемы, отека) и дальнейшим прогрессированием в атрофию и гипо/гиперпигментацию кожи [1]. Очаговую склеродермию относят к числу дерматозов, в этиологии и патогенезе которых до настоящего времени остается много сложных и нерешенных аспектов [2]. Этиология склеродермии представляется как сочетание генетической предрасположенности и воздействия на организм неблагоприятных факторов как внешнего, так и внутреннего генеза. Эти факторы вызывают аутогенную активацию иммунной системы и нарушение гемоциркуляции [3, 4].
В настоящее время известны три наиболее распространенные теории патогенеза ограниченной склеродермии: иммунные нарушения, сосудистая патология и обменные нарушения в соединительной ткани. По всей видимости, патогенные факторы являются провоцирующими, или пусковыми, способны вызвать изменения антигенных свойств собственных тканей и стимулировать синтез аутоантител, которые впоследствии повреждают сосуды [5].
Одним из главных и характерных для локализованной склеродермии признаков считается повышенная продукция и депонирование в коже и подлежащих тканях коллагена и других компонентов экстрацеллюлярного матрикса. Полагают, что активация фибробластов обусловлена цитокинами, высвобождаемыми лимфоцитами, макрофагами и эндотелиальными клетками. Профиброзным действием обладают трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), фактор роста фибробластов (FGF), инсулиноподобный фактор роста (IGF), фактор роста соединительной ткани (CTGF), ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-6 [6].

Привлечению в патологический очаг лимфоцитов и клеток миелоидного происхождения с последующей продукцией цитокинов способствуют так называемые распознающие рецепторы врожденного иммунитета — Toll-подобные рецепторы (TLR) [7]. Существует мнение, что периодически возникающие химические, инфекционные, механические или аутоиммунные повреждения у генетически предрасположенных лиц вызывают активацию фибробластов. Распознающие рецепторы врожденного иммунитета все чаще признают ключевым фактором в развитии фиброза при системной склеродермии. Однако сведений об уровне экспрессии Toll-подобных рецепторов в патологически измененных участках кожи при ограниченной склеродермии найти не удалось.

Активация TLR приводит не только к экспрессии цитокинов, но и индуцирует выработку противомикробных пептидов — β-дефенсинов. Помимо противомикробной активности, дефенсины также принимают участие в процессах, связанных с повреждением, рубцеванием и восстановлением тканей.
Человеческие β-дефенсины (hBD) продуцируются многими типами эпителиальных клеток. В частности, hBD-1 экспрессируются в эпителии кожи, почках, эпителии дыхательного и женского репродуктивного тракта [8]. Человеческие дефенсины hBD-2, hBD-3 экспрессируются в воспаленной коже и впервые были обнаружены при псориазе [9].
Роль механизмов врожденного иммунитета в патогенезе ограниченной склеродермии практически не изучена. Нам не удалось найти литературных источников с данными об изменении показателей врожденного иммунитета в очаге при ОСД. Однако не исключено, что исследование показателей врожденного иммунитета позволит разработать новые подходы в диагностике, прогнозе и лечении ОСД.
Для исследования были выбраны следующие маркеры: TLR2, противомикробный пептид HBD-1 и TNF-α. Выбор этих молекул обусловлен их важной функцией в механизмах врожденного иммунитета кожи. TLR2, как известно, является рецептором, распознающим широкий спектр патогенов и эндогенных лигандов. Взаимодействие TLR2 с лигандами индуцирует экспрессию генов противомикробных пептидов и провоспалительных цитокинов, в том числе и TNF- α. HBD-1-дефенсин осуществляет защиту от различных вирусов, бактерий и грибов. Наряду с противомикробной активностью HBD-1 влияет на процессы рубцевания тканей, регулируя функцию фибробластов. Известна ведущая роль TNF- α в индукции воспаления и в процессах репарации тканей [8].
Цель работы — исследование экспрессии генов TLR2, HBD-1 и TNF-α в очаге патологического процесса и в непораженном участке кожи больных ограниченной склеродермией.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Под нашим наблюдением были 63 пациента, 10 мужчин и 53 женщины, в возрасте от 16 до 74 лет. Диагностированы следующие клинические формы: у 49 пациентов — бляшечная склеродермия, у 8 — идиопатическая атрофодермия Пазини–Пьерини, у 6 отмечено сочетание бляшечной склеродермии со склероатрофическим лихеном. Давность заболевания составляла от 1 мес до 6 лет. В контрольную группу вошли 8 здоровых доноров. Всем пациентам проведено общеклиническое обследование, включая консультацию терапевта, эндокринолога, хирурга и при необходимости других специалистов, проанализированы также результаты исследований крови, мочи. Из образцов-соскобов с поверхности кожи в районе очага склеродермии и в районе нормальной ткани была выделена РНК с использованием набора реагентов RNeasy Mini Kit (QIAGEN, Германия) строго по протоколу. Для определения уровня экспрессии исследуемых генов с помощью реакции обратной транскрипции была получена кДНК. На следующем этапе исследования с полученной в результате реакции обратной транскрипции кДНК проводили полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) на приборе ДТ-96 («ДНК-Технология», Россия).
Реакцию проводили с использованием «Набора реагентов для проведения ПЦР-РВ в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I» («Синтол», Россия). Последовательность праймеров для определения уровня экспрессии данных генов подбирали с помощью программы Vector NTI Suite 8.0 (последовательности мРНК были получены в базе данных GenBank). Системы для определения экспрессий генов TLR2, HBD-1 и TNF- α были отработаны ранее [10]. Уровень экспрессии исследуемых генов определяли относительно экспрессии гена β-актина [11].
Данные по экспрессии исследуемых генов представлены в виде количества копий исследуемого гена относительно 103 копий гена актина. Результаты на диаграммах и в таблице представлены в виде медианы и интерквартильного диапазона (25–75-й процентили). Статистическую обработку проводили с использованием программы Statsoft Statistica v. 6.0. Достоверность получаемых различий между группами оценивали с помощью критерия Манна–Уитни. Различия между группами считали достоверными при р <0,05 [12].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе проведено комплексное исследование экспрессии генов важных молекул врожденного иммунитета: TLR2, противомикрообного пептида HBD-1 и провоспалительного цитокина TNF-α в очаге патологического процесса, в непораженной коже больных с различными формами ОСД и в коже здоровых доноров.
В результате исследований было выявлено достоверное снижение экспрессии гена TLR2 в очаге патологического процесса при бляшечной форме ОСД по сравнению с кожей здоровых доноров (р <0,01). Характерной особенностью является снижение уровня экспрессии гена TLR2 и в участках непораженной кожи больных бляшечной формой ОСД (рисунок А).
При этом наблюдается увеличение экспрессии гена HBD-1 в 2,5 раза в очаге повреждения по сравнению с кожей здоровых доноров (таблица; рисунок, А). Следует заметить, что в неизмененных участках кожи больных с очаговой формой ОСД ген противомикробного пептида HBD-1 экспрессируется в большей степени, чем в патологическом очаге (р <0,01). У больных с бляшечной формой ОСД выявлено увеличение экспрессии гена TNF- α только в патологически измененных очагах кожи (рисунок, В). В участках здоровой кожи экспрессия гена TNF- α не отличалась от показателей здоровых доноров.
При сочетании бляшечной склеродермии со склероатрофическим лихеном изменения экспрессии генов исследуемых молекул носят схожий характер с группой больных бляшечной формой ОСД (таблица).
При идиопатической атрофодермии Пазини–Пьерини зафиксированы следующие изменения показателей врожденного иммунитета. Экспрессия гена распознающего рецептора TLR2 в патологическом очаге и непораженных участках кожи больных статистически достоверно не отличается от показателей здоровых доноров (таблица). При этом обнаружено выраженное увеличение экспрессии гена TNF- α в изолированных очагах, превышающее показатели кожи здоровых доноров в 5,65 раза (р <0,01).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

При бляшечной форме ОСД в очаге патологических изменений выявлен дисбаланс показателей врожденного иммунитета на уровне экспрессии генов TLR2, НBD-1 и TNF-α, проявляющийся в снижении TLR2, увеличении экспрессии генов НBD-1 и TNF-α в сравнении с кожей здоровых доноров. Можно предположить, что снижение экспрессии гена TLR2 является следствием патологического процесса, происходящего в коже больных с ОСД, и свидетельствует о выраженном нарушении процессов распознавания патогенов и эндогенных лигандов.
На сегодняшний день уже известно, что в основе развития очаговой склеродермии лежит нарушение функции фибробластов. Последние синтезируют большое количество незрелого коллагена. Исследованиями последних десятилетий доказано, что в процессах образования фиброза в дерме активную роль играют цитокины: провоспалительные, трансформирующие, тромбоцитарные и фибробластные факторы роста.
Известно, что провоспалительные цитокины, и в частности TNF-α, не только принимают участие в развитии воспаления, но и обладают фиброзогенным действием.

Присутствие TNF-α в сыворотке больных ОСД положительно коррелирует с серологическим наличием антител к гистонам, к одноцепочечной ДНК (ssDNA), и TNF-α по праву рассматривают в роли маркера, свидетельствующего о тяжести течения ОСД [13]. Однако увеличение экспрессии гена TNF-α напрямую не опосредовано TLR2-зависимыми механизмами, так как при ОСД наблюдается значительное снижение экспрессии гена TLR2 в коже (рисунок). Как известно, противомикробный пептид HBD-1, наряду с иммунорегуляторной активностью и противомикробным действием, участвует в процессах репарации [14]. Можно предположить, что гиперэкспрессия гена HBD-1 в коже больных с ОСД изменяет синтез коллагена и способствует формированию фиброза.
Увеличение экспрессии гена HBD-1 можно рассматривать как один из возможных маркеров развития ОСД. При таких формах ОСД, как идиопатическая атрофодермия Пазини–Пьерини, ограниченная форма в сочетании со склероатрофическим лихеном выявлено достоверное увеличение экспрессии этого гена именно в непораженных участках кожи (таблица). В очаге патологического процесса экспрессия гена HBD-1 увеличена, но недостоверно, что может быть обусловлено небольшой выборкой пациентов исследуемых групп. Полученные результаты позволяют проанализировать роль механизмов врожденного иммунитета в патогенезе очаговой склеродермии, а также в комплексе с клиническими показателями могут быть использованы для прогноза течения ОСД и оценки эффективности проводимой терапии.

ВЫВОДЫ

В патологически измененных очагах кожи при ограниченной склеродермии выявлены нарушения врожденных механизмов защиты на уровне экспрессии генов TLR2, HBD-1 и TNF-α, следствием чего может быть нарушение процессов распознавания патогенов и эндогенных лигандов, индукция локального воспаления и возможная стимуляция формирования фиброза. Полученные результаты об увеличении экспрессии гена противомикробного пептида HBD-1 в непораженных участках кожи больных с ограниченной формой ограниченной склеродермии можно рассматривать как один из возможных маркеров развития этого дерматоза.