Туберкулез — одно из наиболее опасных инфекционных заболеваний: по оценкам Вcемирной организации здравоохранения более 2 млрд человек в мире являются носителями его возбудителя — Mycobacterium tuberculosis. Ежегодно от туберкулеза умирает около 10,8 млн человек [1]. Основной проблемой контроля за заболеванием на сегодняшний день является возникновение и повсеместное распространение штаммов M. tuberculosis с множественной и широкой лекарственной устойчивостью (МЛУ — устойчивость к рифампицину и изониазиду; ШЛУ — дополнительная к МЛУ устойчивость к препаратам ряда фторхинолонов и одному из инъекционных препаратов второго ряда противотуберкулезной терапии) [2, 3]. Таким образом, одной из главных задач в борьбе с туберкулезом является разработка противотуберкулезных препаратов с новым механизмом действия.

Ранее нами была исследована антимикобактериальная активность соединений класса замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов [4], которые также проявили активность в оригинальной тест-системе M. smegmatis aphVIII+, валидированной для поиска ингибиторов микобактериальных серин-треониновых протеинкиназ (СТПК) [5]. Однако для окончательного подтверждения механизма действия замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов, а также механизма возникновения устойчивости к данным соединениям требовалось обнаружить мутации, приводящие к устойчивости микобактерий к этим веществам с использованием M. smegmatis в качестве модельного организма [6].

Целью данного исследования было секвенирование и сравнительный геномный анализ мутантов M. smegmatis, устойчивых к трем соединениям класса замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов: TSV-395, TSV-402 и NIK-1283.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы микобактерий и условия культивирования

В работе использованы следующие штаммы микобактерий: 1) M. smegmatis mc2 155 (штамм дикого типа); 2) штаммы M. smegmatis at^R8, at^R9, at^R10, отобранные как устойчивые к соединению TSV-395; 3) штаммы M. smegmatis at^R1, at^R2, at^R11, отобранные как устойчивые к соединению TSV-402; 4) штаммы M. smegmatis at^R14, at^R17, at^R19, отобранные как устойчивые к соединению NIK-1283. Использованные мутантные штаммы имели перекрестную лекарственную устойчивость ко всем трем соединениям. Культуры микобактерий выращивали в жидкой среде Middlebrook 7H9 (Himedia, Индия) с добавлением OADC (Himedia, Индия), 0,1 % Tween-80 и 0,1 % глицерина при 37 °C и 250 об./мин.

Выделение ДНК микобактерий и полногеномное секвенирование

ДНК микобактерий очищали из 15 мл жидкой культуры по методике, описанной в [7]. После предварительной очистки ДНК обрабатывали РНКазой А (ThermoFischerScientific, США) и проводили экстракцию смесью из фенола, хлороформа и изоамилового спирта в соотношении 25 : 24 : 1 по объему.
Очищенную ДНК использовали для приготовления библиотек с набором реагентов Nextera (Illumina, США) и дальнейшего секвенирования на платформе Illumina MiSeq с набором реагентов MiSeq Reagent Kit v3 2x315 bp (Illumina, США). ДНК штамма дикого типа секвенировали с набором реагентов MiSeq Reagent Kit v2 2x150 bp (Illumina, США). Полученные данные были добавлены в базу данных Sequence Read Archive (SRA) NCBI, номер записи: SRP145443.

Обработка данных полногеномного секвенирования и сравнительный геномный анализ

Полученные прочтения выравнивали при помощи программы BWA-MEM [8] на референсный геном (NC_008596.1, PRJNA57701), затем создавали файл multiple pileup при помощи команды mpileup программы SAMtools [9] с опциями (-B -f). Определение однонуклеотидных замен выполняли командой mpileup2snp программы VarScan 2.3.9 [10] с опциями (--min-avg-qual 30 --min-var-freq 0.80 --p-value 0.01 --output-vcf 1). Для аннотации использовали скрипт vcf_annotate.pl, любезно предоставленный сотрудницей лаборатории генетики микроорганизмов Института общей генетики им. Н. И. Вавилова Натальей Михеечевой. Затем отбирали однонуклеотидные замены, не присутствующие в штамме дикого типа и находящиеся внутри открытых рамок считывания. Поиск гомологов проводили в программе BLAST NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сравнительный геномный анализ

После сборки геномов был проведен сравнительный геномный анализ мутантных штаммов и штамма дикого типа, который выявил следующие уникальные однонуклеотидные замены:

1) замену CGT>AGT в кодоне 233 (R>S) гена MSMEG_0641 (binding-protein-dependent transporters inner membrane component) у мутанта at^R10; 
2) замену ACG>GTG в кодоне 52 (T>V) гена MSMEG_1380 (transcriptional regulator) у мутантного штамма at^R19; 
3) инсерции аминокислот VG в позиции 51 гена MSMEG_1380 (transcriptional regulator) у мутантных штаммов at^R11, at^R17; 
4) замену TAC>CAC в кодоне 52 (Y>H) гена MSMEG_1601 (hypothetical protein) у мутантных штаммов at^R1, at^R2, at^R8, at^R11, at^R14, at^R17 и at^R19;
5) замену TAC>TGC в кодоне 188 (Y>C) гена MSMEG_2087 (transporter small conductance mechanosensitive ion channel (MscS) family protein) у мутантного штамма at^R9.

Гены, в которых найдены перечисленные мутации, не являются псевдогенами, однако функции кодируемых ими белков экспериментально не подтверждены.

Идентификация генов-гомологов в геноме M. tuberculosis

При помощи BLAST удалось выявить гомологи белков M. tuberculosis, несущих обнаруженные мутации (таблица).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение механизма действия препарата является важнейшим этапом в разработке любого современного антибактериального лекарства. Получение мутантов, устойчивых к разрабатываемому соединению и выявление определяющих устойчивость мутаций — классический подход к установлению наиболее вероятных мишеней воздействия антибиотика. Нами проведен сравнительный геномный анализ девяти мутантов, устойчивых к соединениям класса замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов (полученных на трех различных соединениях, но имеющих к ним перекрестную устойчивость). Анализ генома мутантов позволил выбрать в качестве наиболее вероятных драйверов лекарственной устойчивости пять мутаций в четырех генах.

Две мутации обнаружены в генах, кодирующих трансмембранный транспортер (MSMEG_0641) и механочувствительный канал (MSMEG_2087), и могут влиять на транспорт соединений внутрь клетки и из нее. Две мутации обнаружены в гене белка MSMEG_1380, являющемся транскрипционным регулятором семейства TetR. Белки этого семейства могут участвовать в регуляции лекарственной устойчивости путем контроля экспрессии различных мембранных транспортеров. Так, у M. abscessus регулятор TetR-семейства активирует экспрессию клеточных транспортеров MmpS5/MmpL5, связанных с реализацией лекарственной устойчивости к производным тиацетазона [11].

Из обнаруженных мутаций наиболее интересной для дальнейших исследований представляется мутация в гене MSMEG_1601; она встречается у семи из девяти мутантов. Данный ген крайне консервативен для рода Mycobacterium: он присутствует в геномах всех микобактерий (и ряда других актинобактерий), включая сильно редуцированный геном M. leprae, и относится к так называемым core hypotheticals — высококонсервативным белкам с неопределенной функцией [12] (хотя не является жизненно-необходимым для роста микобактерий in vitro [13]). Протеомный анализ штаммов M. tuberculosis различных линий показал, что белок Rv3412 (гомолог MSMEG_1601) присутствует в увеличенном количестве в вирулентных штаммах, в частности в штамме линии LAM, в сравнении с аттенюированным штаммом M. bovis BCG. Это позволило авторам сделать предположение о возможном участии данного белка в инфекционном процессе [14].

ВЫВОДЫ

Нами обнаружено пять мутаций в четырех генах, вероятно приводящих к устойчивости микобактерий к соединениям класса замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов. Участие каждой из мутаций еще предстоит подтвердить методами обратной генетики, однако уже сейчас большой интерес представляет ген, кодирующий белок MSMEG_1601: в отличие от других выявленных мутантных генов он не связан с трансмембранным транспортом и может служить прямой биомишенью замещенных имидазо[1,2-b][1,2,4,5]тетразинов.