Большинство представителей микрофлоры кишечника человека и животных относят к трудно культивируемым или некультивируемым группам микроорганизмов, поэтому для оценки состава микробиоты в настоящее время преимущественно применяют технологии массового параллельного секвенирования молекул ДНК в исследуемом образце, например фрагментов генов, кодирующих 16S рРНК, или фрагментов геномной ДНК [1, 2]. Однако часто интерпретация получаемых данных вызывает затруднения, так как анализируемые нуклеотидные последовательности не всегда могут быть соотнесены с какими-либо известными бактериями или бактериофагами [3–5]. Эти подходы имеют и тот недостаток, что с их помощью с большей эффективностью можно охарактеризовать относительное соотношение доминирующих групп бактерий, в то время как точное численное содержание доминирующих или минорных по количеству (и не всегда по параметру качественного разнообразия и реализуемым функциям) таксонов остается за рамками таких исследований [6, 7]. Для более точного количественного определения бактерий применяют метод ПЦР в режиме реального времени с использованием видоспецифичных или группоспецифичных праймеров и последующей нормализацией полученных результатов на рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие клонированные участки амплифицируемых фрагментов генов [8]. Однако этот метод позволяет скорее определять общее количество копий амплифицируемых участков ДНК в исследуемом материале, а не число жизнеспособных бактериальных клеток. Кроме того, ввиду трудоемкости постановки метода, особенно в исследованиях, направленных на численное определение широкого спектра микроорганизмов, этот подход, в основном, используют для анализа состава крупных таксономических кластеров микроорганизмов (родов, семейств, групп), нежели отдельных известных видов. Таким образом, наряду с развитием технологий, основанных на секвенировании генетического материала микроорганизмов, по-прежнему актуально совершенствование методов их культивирования, поскольку оно позволяет решать задачи по поиску, выделению, определению численности и изучению биологических свойств новых штаммов уже известных бактерий, а также ранее не изученных таксонов [9].
Целью работы было оценить потенциал использования культурального метода для оценки качественного и количественного составов кишечной микробиоты здоровых детей путем высева образцов испражнений на часто используемые в лабораторной практике питательные среды, поддерживающие рост требовательных бактерий.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Изучение параметров микробной колонизации толстой кишки проводили у группы из 20 здоровых детей обоего пола, проживающих в г. Москва, 17 из которых регулярно посещали детские дошкольные учреждения, а трое детей находились на домашнем воспитании. Отбор детей проводили авторы исследования. Возраст обследуемых составил от 2 лет 11 месяцев до 4 лет 10 месяцев (средний возраст — 3 года 5 месяцев), из которых было 12 мальчиков и 8 девочек. Критерии включения: дети обоего пола; возраст детей от 2,5 до 4 лет; наличие согласия родителей на проведение исследования. Критерии исключения: дети иного возраста; наличие любого хронического заболевания, такого как сахарный диабет, бронхиальная астма, желудочно-кишечные заболевания (целиакия, функциональный запор, синдром короткой кишки, или воспалительные заболевания кишечника); наличие пищевой аллергии или родительская убежденность в непереносимости лактозы у ребенка; выраженная избирательность в употреблении пищевых продуктов; применение антибиотиков, иммуномодулирующих, стероидных или пробиотических лекарственных препаратов в течение 6 месяцев до исследования; перенесенный за последние 6 месяцев до исследования инфекционный гастроэнтерит, подтвержденный лабораторными исследованиями; наличие перенесенных операций на желудочно-кишечном тракте.

Материалом для исследования служили фекалии детей, которые родители собирали стерильным шпателем и помещали в стерильный транспортный контейнер. Исследование проводили при условии, что количество помещенного в контейнер материала составляло не менее 15 г, и время его доставки в лабораторию не превышало 2 ч от момента забора. В лаборатории сразу после получения исследуемый материал гомогенизировали, готовили его десятикратные серийные разведения (от 10 до 10⁹ раз) в пробирках со стерильной жидкой средой Schaedler Anaerobe Broth (Oxoid, Basingstoke; Великобритания) и высевали аликвоты в объеме 0,1 мл из соответствующих разведений на чашки Петри с питательными средами. Выделение строго анаэробных бактерий проводили на Schaedler Anaerobe Agar (Oxoid, Basingstoke; Великобритания) с добавлением 5 % (v/v) дефибринированной бараньей крови, Anaerobe Basal Agar (Oxoid, Basingstoke; Великобритания) с добавлением бараньей крови, Columbia Agar (bioMérieux, Marcy l'Etoile; France) с добавлением бараньей крови. Посев на питательные среды проводили из разведений испражнений в 10⁷, 10⁸, и 10⁹ раз. Бифидобактерии и сульфатредуцирующие бактерии выделяли также на Bifidobacterium Agar (Himedia Labs Inc.; Индия) и Perfringens Agar Base (Himedia Labs Inc.; Индия) соответственно из разведений исследуемого материала в 10⁵, 10⁷ и 10⁸ раз. Чашки Петри с посевами инкубировали в анаэростатах (Schutt Labortechnik GmbH; Германия), заполненных газовой смесью (85% N₂, 10% H₂, 5% CO₂), в присутствии платиновых катализаторов при 37 °С в течение 72 ч. Молочнокислые бактерии культивировали на среде Lactobacillus MRS Agar (Himedia Labs Inc.; Индия) из фекалий разведением в 10³ и 10⁵ раз, чашки инкубировали в анаэростатах (GasPak; США) в атмосфере — 7% СО₂ 48 ч. Аэробные бактерии выделяли из разведений исследуемого материала в 10, 10³, 10⁵ и 10⁷ раз на средах: Endo Agar (Becton Dickinson and Company, США), Salmonella–Shigella-Agar (bioMerieux Marcy l'Etoile; Франция), Gelatin Mannitol Salt Agar (Stаphylococcus Agar # 110, Himedia Labs Inc.; Индия), m-Enterococcus Agar (Difco Laboratories, Franklin Lakes; США), Columbia Agar (bioMérieux, Marcy l'Etoile; Франция) с добавлением 5 % (v/v) бараньей крови. Для выделения грибов использовали среду Sabouraud Chloramphenicol 2 Agar (bioMérieux, Marcy l'Etoile; Франция).

После инкубирования чашек с посевами при макроскопическом исследовании выросших колоний определяли их морфологические типы и проводили подсчет отдельно для каждого типа. Кроме того, материал из колоний выявленных типов подвергали микроскопическому исследованию после окраски по Граму и субкультивировали путем пересева на новые чашки Петри с той же средой и последующим инкубированием чашек в анаэробных или аэробных условиях с целью получения биомассы бактерий для идентификации и консервации. Частично, выделенные штаммы микроорганизмов сохраняли путем лиофильного высушивания микробной суспензии после замораживания в растворе 10% сахарозы/1% желатины (w/v) в лиофильной сушке SB1 (Chemlab; Великобритания). Пробирки с лиофильно высушенными штаммами микроорганизмов хранили при температуре –80°С.

Первичную идентификацию бактерий и грибов проводили при помощи масс-спектрометрического метода MALDI TOF MS на приборе Vitek MS Plus (bioMérieux; Франция) и программы Saramis Premium v. 4.10 в соответствии с рекомендациями производителя оборудования [10, 11]. Штаммы бактерий, видовую принадлежность которых не удалось установить при помощи метода MALDI-TOF масс- спектрометрии, идентифицировали путем секвенирования фрагмента гена 16S рРНК [12, 13]. Кроме того, этот же метод использовали выборочно для подтверждения правильности видовой идентификации бактерий методом масс-спектрометрии. Путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) осуществляли амплификацию участка гена 16S рРНК с использованием универсальных бактериальных праймеров 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) и 1492R (5'-ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3') в течение 35 циклов со следующей программой: денатурация — 20 с при 94 °С; отжиг праймеров — 20 с при 58 °С; элонгация — 90 с 72 °С.

Полученный ПЦР-продукт очищали с использованием набора Cleanup Standard («Евроген»; Россия). Секвенирование амплифицированного фрагмента ДНК по Сэнгеру с праймера UF1 проводили в компании «Евроген» (Москва, РФ). Определение границ отсечения последовательностей по качеству электрофореграммы осуществляли визуально с использованием программы Chromas Lite Chromas Lite, версия 2.6.6 (Technelysium Pty. Ltd.; Австралия). Видовую принадлежность бактерий устанавливали на основе поиска полученных нуклеотидных последовательностей в базе данных GenBank при помощи алгоритма Megablast. Результат сравнения считали соответствующим уровню вида в том случае, когда его частично секвенированная последовательность гена 16S рРНК имела сходство на уровне ≥ 98,7% с последовательностью ближайшего известного бактериального вида в базе данных GenBank [14].

Количество бактерий выражали в log₁₀ колониеобразующих единиц в 1 г исследуемого материала (log₁₀ КОЕ/г). КОЕ/г исследуемого материала было вычислено с использованием формулы: КОЕ/г = число колоний соответствующего вида микроорганизмов, выросших на чашке (или среднее число колоний соответствующего вида микроорганизмов, в случаях, когда бактерии одного вида давали рост на разных средах или давали рост только на одной из использованных сред, но определялись более чем в одном разведении) × 10 × степень разведения. Общее количество культивированных микроорганизмов на образец вычисляли путем сложения количественных значений отдельных видов.
Статистическую обработку данных проводили с использованием критерия Манна–Уитни и точного теста Фишера, поправку на множественные сравнения осуществляли с использованием метода Холма–Бонферрони. Тенденцию к образованию кластеров проверяли с использованием алгоритма VAT [15] и метода главных компонент.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

От 20 здоровых детей всего было выделено 1819 штаммов микроорганизмов. Видовую идентификацию большинства штаммов проводили при помощи масс-спектрометрического метода MALDI TOF MS. Для установления таксономической принадлежности 140 штаммов бактерий, которые не удалось идентифицировать методом масс-спектрометрии, проводили секвенирование фрагмента гена 16S рРНК. Сравнительный анализ полученных нуклеотидных последовательностей с базой данных GenBank показал, что 130 штаммов бактерий принадлежали к 88 известным видам, а 10 относились к новым, еще не изученным таксонам бактерий. Количество выявленных видов микроорганизмов на один образец варьировало от 21 до 48 и в среднем составило 34 ± 8.
Общее количество жизнеспособных бактерий на 1 г фекалий варьировало от 10,0 до 11,1 log₁₀ КОЕ/г и в среднем составило 10,6 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г.
В целом, было обнаружено, что выделенные штаммы принадлежали к 7 типам, 13 классам, 18 порядкам, 33 семействам, 77 родам и 149 видам домена бактерий. Также было выделено 3 вида грибов, относящихся кдвум семействам порядка Saccharomycetales.
Снижение размерности методом главных компонент, а также использование алгоритма VAT не выявили тенденции к образованию кластеров из микробиоценозов обследуемых детей на основании полученных данных о количественном и качественном составе, что не позволяет сгруппировать микробиоценозы в этом исследовании в энтеротипы или их аналоги. Не было выявлено статистически значимых различий в микробном составе кишечной микробиоты в зависимости от возраста и пола детей, что может быть обусловлено малым размером и гомогенностью выборки.

Родовая принадлежность, частота встречаемости и количественный уровень микроорганизмов, выделенных из образцов фекалий 20 здоровых детей, представлены в табл. 1–табл. 5. Выявлено, что доминирующие по количеству и частоте встречаемости бактерии принадлежали к типам Firmicutes (9,8 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г), Bacteroidetes (10,3 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г), Actinobacteria (10,0 ± 0,5 log₁₀ КОЕ/г) и Proteobacteria (8,5 ± 1,1 log₁₀ КОЕ/г). Представители каждой из этих групп бактерий были обнаружены у всех детей. Кроме того, у 25% детей из испражнений были получены в среднем количестве 9,1 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г в чистой культуре бактерии вида Akkermansia muciniphila, относящиеся к типу Verrucomicrobia, и у двух детей Fusobacterium mortiferum (8,8 и 8,6 log₁₀ КОЕ/г), представители типа Fusobacteria. От одного ребенка в концентрации, составившей 10⁹ log₁₀ КОЕ/г испражнений, был выделен штамм бактерий Victivallis vadensis, относящихся к типу Lentisphaerae.

Тип Actinobacteria включал в себя два класса бактерий Actinobacteria и Coriobacteriia (табл. 1). Бактерии класса Actinobacteria принадлежали к 4 порядкам и 4 семействам, среди которых доминировали представители семейств Bifidobacteriaceae и Propionibacteriaceae. Бифидобактерии, частота встречаемости которых составляла 100% случаев, были одними из доминирующих микроорганизмов в кишечной микрофлоре здоровых детей. Всего у детей было выделено 6 видов бифидобактерий, среди которых преобладали B. longum, B. bifidum, B. adolescentis, и бифидобактерии группы B. catenulatum/pseudocatenulatum.

Класс Coriobacteria в большей степени был представлен семействами Coriobacteriaceae и Eggerthellaceae, доминирующими видами которых были Collinsella aerofaciens и Eggerthella lenta.

Тип Bacteroidetes включал 5 семейств бактерий только одного порядка Bacteroidales (табл. 2). Семейство Bacteroidaceae было представлено одним родом Bacteroides, к которому относилось 14 обнаруженных видов. Частота выделения бактероидов составляла 100% случаев, а их среднее количество было равно 10,1 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г испражнений. Среди бактероидов у здоровых детей доминировали виды B. dorei/vulgatus и B. ovatus/ xylanisolvens, а также B. uniformis, B. fragilis и B. thetaiotaomicron.

Семейство Rikenellaceae также было представлено только одним родом Alistipes, к которому относилось 9 выделенных видов бактерий. Частота встречаемости Alistipes у здоровых детей составила 90% случаев. Среднее количество бактерий этого рода было равно 9,5 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г, доминировали виды A. onderdonkii, A. putredinis и A. finegoldii.

Бактерии, относившиеся к семейству Porphyromonadaceae, были выделены от 75% детей и относились к трем родам Parabacteroides, Barnesiella и Coprobacter. Доминирующими видами этих таксонов были P. distasonis, P. merdae и B. intestinihominis, обнаруженные у 45%, 35% и 40% детей соответственно. Причем почти во всех случаях, когда были обнаружены бактерии этих таксономических групп, их концентрация составляла или была близка к 10⁹ КОЕ/г исследуемого материала.

Бактерии семейства Prevotellaceae оказались наиболее редкими представителями порядка Bacteroidales при использованном пороге обнаружения анаэробных бактерий, составлявшем не менее 10⁸ микробных клеток на 1 г испражнений. В целом от трех детей (15%) было выделено 5 штаммов бактерий этой группы, относящихся к видам Prevotella copri, P. melaninogenica, P. rara и Paraprevotella clara.

Тип Firmicutes отличался наибольшим разнообразием входящих в него таксонов и был представлен четырьмя классами бактерий, включавшими 7 порядков, 17 семейств, 45 родов и 93 вида микроорганизмов, в том числе новые таксоны бактерий, обнаруженные в этом исследовании (табл. 3). Класс Clostridia был представлен только порядком Clostridiales, к которому относились 47 видов бактерий, принадлежавших к 30 родам и 6 семействам. Представители семейства Lachnospiraceae обнаружены у 85% детей в средней концентрации, составившей 9,0 ± 1,0 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала, и были наиболее часто встречающимся таксоном это класса. Среди видов бактерий, входивших в это семейство и обнаруживаемых чаще других, были Clostridium clostridioforme, определявшиеся у 55% детей в средней концентрации, равной 8,2 ± 1,0 log₁₀ КОЕ/г. Другими часто встречавшимися родами семейства Lachnospiraceae были Blautia (у 65% детей в средней концентрации 8,9 ± 0,9 log₁₀ КОЕ/г), а также бактерии рода Anaerostipes (у 40% детей в концентрации 8,2 ± 1,0 log₁₀ КОЕ/г). Еще одним часто встречающимся семейством бактерий класса Clostridia были представители Ruminococcaceae (у 65% детей в средней концентрации 8,8 ± 0,5 log₁₀ КОЕ/г) и в большей степени представленные бактериями видов Flavonifractor plautii, Ruthenibacterium lactatiformans и Anaerotruncus colihominis. Стоит отметить, что бактерии таких видов семейства Ruminococcaceae, как Faecalibacterium prausnitzii и Gemmiger formicilis, которые по результатам секвенирования библиотек генов 16S рРНК составляют доминирующую часть нормальной микрофлоры кишечника человека [16], были выделены нами только от одного ребенка. Этот результат скорее указывает на необходимость использования для их выделения специальных питательных сред и технологий культивирования, максимально исключающих контакт исследуемого материала и сред с посевами с кислородом воздуха, ввиду чрезвычайно высокой чувствительности к нему бактерий этих таксонов.

Еще одним часто определявшимся таксоном бактерий типа Firmicutes были представители семейства Erysipelotrichaceae (класс Erysipelotrichia, порядок Erysipelotrichales), которые были обнаружены у 55% здоровых детей в средней концентрации, составившей 8,5 ± 1,0 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала. Среди 6 родов и 9 видов бактерий этого семейства доминировали Clostridium innocuum и Clostridium ramosum — их выявляли с частотой, равной 40% в концентрации, превышавшей 10⁸ КОЕ/г исследуемого материала.

Бактерии, относящиеся к классу Negativicutes, были обнаружены у 100% детей в средней концентрации, равной 8,9 ± 0,7 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала. Доминирующими таксонами этой группы были представители семейств Veillonellaceae, к которым относились бактерии родов Veillonella и Dialister (у 35% и 45% детей соответственно), а также семейства Acidaminococcaceae, в основном представленное бактериями вида Phascolarctobacterium faecium, высеянными в высокой концентрации из фекалий 40% детей.

Из бактерий толстой кишки, относящихся к типу Proteobacteria, выявлены представители классов Betaproteobacteria, Deltaproteobacteria и Gammaproteobacteria (табл. 4). Класс Betaproteobacteria включал различные виды бактерий из семейства Sutterellaceae (выделены у 60% детей в средней концентрации 8,8 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала). Класс Deltaproteobacteria в основном был представлен образующими сероводород бактериями вида Bilophila wadsworthia (выделены из фекалий 55% детей в средней концентрации 8,0 ± 0,8 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала). Наконец, класс Gammaproteobacteria был представлен только бактериями из родов, входящих в семейство Enterobacteriaceae, при этом Escherichia coli были обнаружены у 100% детей в средней концентрации 7,2 ± 0,4 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала. Другими относительно часто высеваемыми представителями семейства были бактерии видов Enterobacter cloacae (30%), Citrobacter freundii (20%) и Klebsiella pneumoniae (20%) в концентрациях, обычно не превышавших 10⁶ КОЕ/г исследуемого материала.

Грибы были обнаружены у 45% здоровых детей в количестве 3,4 ± 1,4 log₁₀ КОЕ/г исследуемого материала, причем все выделенные штаммы принадлежали к порядку Saccharomycetales (табл. 5). В испражнениях 35% детей были определены грибы рода Candida семейства Debaryomycetaceae, относившиеся в основном к виду C. albicans. Кроме этого, у двух детей были обнаружены грибы, принадлежавшие виду Clavispora lusitaniae семейства Metschnikowiaceae.

Таксономические свойства 10 штаммов бактерий, которые были выделены при выполнении этих исследований и видовую принадлежность которых установить не удалось, представлены в табл. 6. Большинство (7 из 10 штаммов) принадлежали к типу Firmicutes. Четыре из них имели филогенетическую связь с видами из родов Blаutia, Flintibacter и Lachnoclostridium из семейства Lachnospiraceae. Два клона были близки к разным видам из семейства Ruminococcaceae, и еще один клон был филогенетически сходен с представителями рода Lactonifractor из семейства Clostridiaceae. Кроме того, один клон нового таксона бактерий был связан с типовым штаммом, принадлежащим семейству Sutterellaceae, относящемуся к типу Proteobacteria, и по одному клону принадлежали к родам Parabacteroides и Bacteroides (семейства Porphyromonadaceae и Bacteroidaceae соответственно, тип Bacteroidetes).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Выбор возрастной группы для исследования был обусловлен тем, что качественные и количественные параметры состава микрофлоры кишечника у детей приближаются к значениям, характерным для взрослых людей, приблизительно к трехлетнему возрасту [17]. К этому возрасту кишечная микрофлора приобретает относительную композиционную стабильность, трактуемую как характерная для отдельного индивидуума устойчивость к изменению относительной численности видов с течением времени [18].
Основные проблемы, возникающие при использовании культуральных методов в исследованиях микробиоты кишечника, связаны с подбором питательных сред, которые должны поддерживать рост требовательных строго анаэробных бактерий, и необходимостью проведения видовой идентификации многочисленных штаммов микроорганизмов, растущих на этих средах. В работе мы использовали известные питательные среды, хорошо зарекомендовавшие себя в том числе для целей выделения строго анаэробных бактерий микрофлоры кишечника. В частности, для выделения строго анаэробных бактерий мы использовали 5 различных питательных сред, разлитых в чашки Петри, которые после посева инкубировали при 37 °С в микроанаэростатах в анаэробной газовой среде.
Ранее было показано, что увеличение количества используемых питательных сред и количества обследуемых субъектов ведет к увеличению числа выделяемых видов бактерий, что говорит о значительных межиндивидуальных различиях в составе кишечной микробиоты у человека [3]. Это подтверждают и результаты метагеномного секвенирования, выявившие очень высокую изменчивость численности (в 12–2200 раз) для 57 наиболее распространенных видов микроорганизмов у людей [19]. В нашем исследовании, несмотря на то что от каждого конкретного ребенка было выделено в среднем 34 ± 8 видов микроорганизмов, в целом у всех детей было обнаружено 159 видов бактерий, включая новые таксоны.

Наибольшее видовое разнообразие (более 90 видов бактерий) нами было обнаружено в составе типа Firmicutes, причем более половины из них принадлежали к классу Clostridia порядка Clostridiales. Доминирующими по частоте встречаемости и по количественному содержанию семействами этого класса были Lachnospiraceae и Ruminococcaceae. Полученные нами данные, характеризующие состав этой части микробиоты у детей в России, хорошо согласуются с результатами ранее проведенных исследований, в которых как культуральными методами, так и посредством анализа нуклеотидных последовательностей библиотек генов 16S рДНК было установлено доминирование этих таксонов в образцах кишечной микробиоты человека [6, 20].
Среди выделенных нами в чистой культуре из испражнений здоровых детей представителей кишечных эндосимбионтов, относящихся в частности к классам Erysipelotrichia и Clostridia, также присутствовали бактерии, для которых была установлена связь с различными инфекционными заболеваниями, поэтому совершенствование методов культивирования и видовой идентификации бактерий этих таксонов имеет не только экологическое, но и клиническое значение. Например, Clostridium innocuum часто ассоциированы с бактериемиями у пациентов с иммунодефицитными состояниями и отличаются устойчивостью к антибактериальным препаратам, используемым для купирования анаэробных инфекций. C. ramosum, которые также были выделены нами, считают вторыми наиболее часто встречающимися бактериями из группы клостридий после C. perfringens, обнаруживаемыми в клиническом материале от детей с абсцессами, перитонитами, бактериемиями и хроническими средними отитами, и третьим наиболее часто встречающимся видом клостридий при бактериемиях у взрослых [21, 22].

Тип Bacteroidetes составил вторую группу по количеству выявленных таксонов после Firmicutes и был представлен 33 видами бактерий, относящихся, однако, только к одному порядку Bacteroidales.
Известно, что Bacteroidales включает в себя основную часть анаэробных неспорообразующих грамотрицательных палочковидных бактерий, колонизирующих желудочно-кишечный тракт человека [23]. Мы обнаружили, что у детей младшего возраста в кишечной микрофлоре доминировали представители семейств Bacteroidaceae, Rikenellaceae и Porphyromonadaceae, которые были выделены из фекалий 100%, 90% и 75% детей соответственно. В более ранней работе для оценки состава доминирующих групп кишечных бактерий из порядка Bacteroidales у детей в возрасте 6 лет мы проводили высев серийных разведений испражнений только на Columbia Agar с добавлением бараньей крови с последующим определением видовой принадлежности выросших анаэробных грамотрицательных палочковидных бактерий при помощи комбинации методов, включающей и рестрикционный анализ амплифицированных фрагментов гена 16S рРНК (ARDRA), а также их секвенирование. В этом исследовании из фекалий 8 детей нами было выделено всего 38 штаммов бактерий, принадлежавших к 13 видам Bacteroidales [12]. В настоящем исследовании для выявления той же группы бактерий мы использовали 3 различные питательные среды с предварительной идентификацией всех выросших бактерий при помощи методов масс-спектрометрии и дополнительным секвенированием гена 16S рДНК, выполненным для штаммов с неясным таксономическим положением. Этот подход позволил нам кроме бактерий, относящихся к другим таксономическим группам, выделить 33 вида бактерий, относящихся к 9 родам и 5 семействам порядка Bacteroidales.
Представители семейства Prevotellaceae, также относящегося к порядку Bacteroidales, среди доминирующих групп бактерий были обнаружены нами только у троих детей (15%). Несмотря на то что к настоящему времени известно около 30 видов превотелл, колонизирующих в основном ротовую полость человека, до недавнего времени в качестве комменсалов кишечника рассматривали только два вида бактерий этого рода — P. copri и P. stercorea. В нашей работе, кроме P. copri и редко изолируемых из кишечника P. melaninogenica, впервые от ребенка были выделены превотеллы недавно описанного нового вида P. rara [24].

В качестве доминирующих групп кишечных бактерий превотеллы преимущественно определяют у людей, в диете которых существенно преобладают продукты растительного происхождения, что связывают со способностью этих бактерий расщеплять растительные полисахариды в дистальных отделах кишечного тракта [20]. Вместе с тем, преобладание в кишечной микробиоте бактерий рода Bacteroides и представителей порядка Clostridiales, которое было зарегистрировано и в нашей работе, ранее было ассоциировано с использованием смешанной диеты, характеризующейся включением в пищевой рацион наряду с растительными продуктами продуктов животного происхождения и легко усваиваемых углеводов [25, 26].

ВЫВОДЫ

Использованный нами подход, основанный на применении широкого спектра питательных сред для выделения трудно культивируемых групп кишечных эндосимбионтов как в аэробных, так и в анаэробных условиях, с последующей видовой идентификацией бактерий с помощью масс-спектрометрического метода и метода сeквенирования гена 16S рРНК, позволил провести анализ качественного и количественного состава доминирующих культивируемых групп микроорганизмов кишечной микрофлоры у детей. В целом полученные путем использования культурального метода результаты о таксономическом составе фекальной микрофлоры детей не противоречат данным, получаемым при использовании молекулярных методов, основанных на сeквенировании бактериальных ДНК. Кроме того, нами были выделены в чистой культуре многочисленные штаммы трудно культивируемых бактерий и 10 штаммов новых бактерий с еще не изученными биологическими свойствами. Полученные данные позволяют расширить представления о спектре культивируемых таксономических групп кишечных бактерий и об их количественном содержании у детей. Выделенные нами штаммы как известных, так и новых таксонов могут быть использованы для изучения широкого репертуара их свойств, в том числе биотерапевтического потенциала в целях создания на их основе новых пробиотических лекарственных препаратов. В то же время многие известные таксоны кишечных эндосимбионтов, включая представителей таких доминирующих родов, как Faecalibacterium и Roseburia, нам выделить не удалось, что указывает на необходимость использования в таких исследованиях более совершенных анаэробных технологий, в частности анаэробных камер на этапах пробоподготовки, посева и учета выросших культур. Сложность и трудоемкость развернутого культурального метода для оценки многокомпонентной кишечной микробиоты не позволяют рекомендовать его для широкого применения в клинической практике, даже если предположить, что в будущем удастся полностью автоматизировать все этапы исследования. Однако отработка методов выделения в чистой культуре и идентификации строго анаэробных кишечных бактерий необходима, так как эти бактерии могут обладать патобиотическим потенциалом и встречаться в клиническом материале (раневое отделяемое, биоптаты, кровь, ликвор и др.), в котором обычное количественное содержание видов бактерий не столь велико.