ISSN Print 2070–7320
ISSN Online 2070–7339
Вестник РГМУ
НАУЧНЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ЖУРНАЛ РНИМУ ИМЕНИ Н. И. ПИРОГОВА
ОБЗОР
Амилоидные белки поверхности микроорганизмов: структура, свойства и значение для медицины
Информация об авторах
1 Кафедра молекулярной биологии, биологический факультет,Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, Москва
2 Лаборатория биохимии и генетики,Национальный институт диабета, заболеваний ЖКТ и почек, Национальный институт здоровья, Бетесда, Мэриленд, США
Для корреспонденции: Калебина Татьяна Сергеевна
Ленинские горы, д. 1, стр. 12, г. Москва, 119899; ur.usm.eebeneg@anibelak
Информация о статье
Финансирование: работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 14-04-01187 А).
Статья получена: 30.09.2015
Статья принята к печати: 07.10.2015
Опубликовано online: 05.01.2017
|
Микробиом человека составляет в среднем 1014 клеток микроорганизмов [1], многие из которых имеют на своей поверхности амилоидные белки. Некоторые исследования последних лет позволяют выдвинуть гипотезу о том, что наличие таких белков может способствовать возникновению многих заболеваний, в том числе развитию системных амилоидозов высших животных и человека, туберкулеза, болезни Альцгеймера [2, 3, 4, 5, 6].
Анализ и глубокое знание процессов и молекулярных механизмов, лежащих в основе сборки амилоидных структур клеток про- и эукариотических микроорганизмов, имеют большие перспективы с медицинской точки зрения. В первую очередь сказанное актуально для разработки методов защиты организма человека и животных от неблагоприятного воздействия амилоидов микроорганизмов. Важно понимание того, как можно наиболее эффективно препятствовать формированию или разрушить уже сформированные патогенными микроорганизмами бактериальные биопленки и как снизить эффект индукции процесса амилоидообразования клетками человека и животных при воздействии амилоидов микроорганизмов.
Амилоиды — это белковые фибриллы, обладающие кросс-β-структурой. Они состоят из мономеров и представляют собой протяженные β-листы, в которых β-тяжи лежат перпендикулярно продольной оси фибриллы и могут располагаться параллельно и антипараллельно друг другу. Расстояние между главными цепями внутри β-листа составляет 0,47 нм, между соседними β-листами — 0,8– 1,2 нм [7, 8]. В стабилизации структуры амилоидных фибрилл играют важную роль водородные связи, образующиеся между пептидными остовами соседних β-тяжей. В стабилизацию структуры амилоидов также, по-видимому, вносят вклад взаимодействия между боковыми группами аминокислотных остатков соседних полипептидов (гидрофобные взаимодействия, солевые мостики, стэкинг-взаимодействия). Для амилоидов характерна высокая устойчивость к изменениям таких параметров окружающей среды, как гидрофобность, концентрация соли, pH, температура, давление, влияние денатурирующих агентов и протеиназ, что обусловлено большим числом взаимодействий, вовлеченных в стабилизацию их структуры [2, 9, 10, 11, 12].
Поскольку амилоиды являются причиной многих широко распространенных неизлечимых патологий (амилоидозов), их давно и активно изучают у человека и животных. Пили (pili, от лат. pilus — волос) были описаны в середине прошлого века у грамотрицательных и грамположительных бактерий [13]. Только совсем недавно, однако, стало понятно, что многие структуры на поверхности микроорганизмов представляют собой амилоидные фибриллы. К настоящему моменту курли (curli, от англ. curl — завиток) или тафи (tafi, от англ. thin aggregative fimbriae — тонкие агрегирующие нити) охарактеризованы у таких родов бактерий, как Escherichia, Neisseria, Yersinia, Shigella и Salmonella [2, 3, 10, 11, 14, 15, 16, 17]. Пили охарактеризованы также у бактерий рода Streptococcus, в частности S. agalactiae, S. pyogenes и S. pneumoniae, у Mycobacterium tuberculosis и у многих других грамположительных бактерий. Процессы сборки этих структур и их роль в колонизации организма хозяина описаны достаточно подробно [13].
Хорошо известно о наличии амилоидов, так называемых гидрофобинов класса I, на поверхности мицелиальных грибов, например Aspergillus fumigatus [18]. Амилоиды встречаются у микроорганизмов среди структурных молекул, адгезинов и токсинов. Растущий список охарактеризованных амилоидов, помимо упомянутых выше структур, включает в себя фенол-растворимые модулины Staphylococcus aureus [12, 19], адгезины у Candida albicans [20, 21], амилоиды, формируемые белком ТаsA у Bacillus subtilis [22, 23, 24].
В процессе изучения амилоидных белков поверхности клеток микроорганизмов возникло понятие «функциональные амилоиды» [25], т. е. белки, формирующие амилоиды, не сопряженные с патологией микробов и выполняющие полезные для их клеток функции. В ряде опубликованных работ указано на формирование функциональных амилоидов не только среди микроорганизмов и высказано предположение, что они существуют во всех доменах живого мира и участвуют в самых различных процессах: от образования биопленок в микробных сообществах до регуляции долговременной памяти у животных [7]. В обзоре мы рассмотрим некоторые примеры участия амилоидных белков поверхности микроорганизмов в развитии заболеваний животных и человека и приведем данные, характеризующие структуру этих амилоидов и условия их формирования.
Амилоиды, принимающие участие в формировании межклеточного матрикса бактерий
Основным белковым компонентом, необходимым для формирования межклеточного матрикса, являются курли или тафи. Они присутствуют на поверхности многих грам-отрицательных бактерий, в т. ч. ряда штаммов Escherichia coli, Salmonella spp. и других Enterobacteriaceae [10, 11, 14, 15, 16, 17]. Курли E. coli связываются со многими белками человека, в частности с фибронектином, ламинином, коллагеном I типа, молекулами главного комплекса гистосовместимости I класса, плазминогеном и некоторыми другими [26, 27, 28, 29], и способствуют патогенезу, облегчая микроорганизму последующее внедрение в организм хозяина [14, 30, 31, 32]. Курли представляют собой фибриллярные структуры, одним концом закрепленные на внешней мембране бактерий. Их длина может достигать нескольких микрометров, а ширина составляет 3–4 нм, при этом курли склонны агрегировать латерально, образуя пучки диаметром до 60 нм [33]. Фибриллы курлей обладают высокой устойчивостью к действию денатурирующих агентов и протеиназ, однако они могут быть деполимеризованы после кратковременной обработки концентрированной муравьиной кислотой [10, 11, 34]. Данные спектроскопии кругового дихроизма (КД-спектроскопии) свидетельствуют, что вторичная структура фибрилл курли богата β-слоями [11], также они взаимодействуют со специфичными для амилоида красителями — конго красным (КК) и тиофлавином Т (ТТ) [11, 27]. Все это позволило классифицировать курли как амилоидные фибриллы [11].
Курли необходимы для формирования бактериальных биопленок и являются основным белковым компонентом образующегося при этом внеклеточного матрикса [33, 35]. Было показано, что гены курли лучше всего экспрессируются при температуре ниже 30 °C, низкой концентрации питательных веществ, низком осмотическом давлении и на стационарной стадии роста, т. е. в условиях, с которыми E. coli и другие энтеробактерии сталкиваются вне организма хозяина. В этих условиях формирование биопленок может способствовать выживанию бактерий [33]. Курли опосредуют присоединение бактерий к множеству поверхностей, включая клетки растений [36, 37], нержавеющую сталь [38], стекло и пластик [33], а также могут существенно усиливать устойчивость клеток микроорганизма к хлору [38] и соединениям двухвалентной ртути [39].
Сборка курлей — строго регулируемый клеткой процесс [14, 40], в котором участвуют белки, кодируемые как минимум двумя оперонами: у E. coli они носят название csgABC и csgDEFG [41]. Курли состоят из двух гомологичных белков — CsgA и CsgB, при этом основным структурным компонентом фибрилл является белок CsgA [27]. Очищенный CsgA in vitro в отсутствие каких-либо других белков формирует амилоидные фибриллы, однако β-тяжи в них уложены не в β-слои, а в β-спирали. In vivo для сборки амилоидных фибрилл CsgA необходимо присутствие CsgB [11, 27, 42]. CsgA, секретируемый клетками E. coli с делецией гена csgB, может полимеризоваться на поверхности клеток, продуцирующих CsgB [11, 14, 27]. Это явление носит название «межбактериальная комплементация» и широко используется в мутационных исследованиях, направленных на выявление генов белков, участвующих в формировании курлей [11, 43]. Межбактериальная комплементация подтверждает, что CsgB является нуклеатором полимеризации CsgA [11].
Большая часть CsgB локализована на бактериальной поверхности, что указывает на верность предположения о нуклеаторной функции CsgB [44]. CsgF обеспечивает правильное сворачивание и локализацию белка-нуклеатора CsgB, вероятно, представляя собой шапероноподобный белок [43]. Периплазматический белок CsgE, по-видимому, участвует в секреции CsgA, а также ингибирует полимеризацию CsgA in vitro [45] за счет прямого взаимодействия между молекулами CsgE и CsgA [46]. Поэтому CsgE можно рассматривать как CsgA-специфичный шаперон. Одним из следствий развития представлений о нуклеаторных способностях белков клеточной поверхности микроорганизмов в процессе формирования амилоидов является то, что некоторые авторы рассматривают амилоидные белки микробного происхождения как реальную опасность для развития амилоидозов и болезни Альцгеймера [47].
Большинство экспериментальных исследований по биогенезу и функциям курлей были выполнены на E.coli и Salmonella spp. Биоинформатический анализ выявил гомологов курлей среди представителей родов Bacteroidetes, Firmicutes и Thermodesulfobacteria [48]. Опероны csgEFG были найдены у большинства бактерий вышеуказанных родов с потенциальными гомологами CsgA и CsgB, в то время как белки CsgC и CsgD часто отсутствовали. Несмотря на то что многие биоинформатические исследования ждут экспериментального подтверждения, есть основания предполагать, что сходные с курлями структуры могут быть более широко распространены у бактерий, формирующих биопленки, чем считали ранее [49].
Адгезин Р1, располагающийся на клеточной поверхности микроорганизма Streptococcus mutans, вызывающего зубной кариес, является амилоидным белком [50]. Данный адгезин индуцировал сдвиг в спектре поглощения красителя КК, зеленое двулучепреломление в окрашенном КК препарате и специфическую флуоресценцию ТТ. Микроскопическими методами в препарате этого адгезина были обнаружены фибриллы, что в совокупности с результатами спектрофотометрического анализа подтверждало его амилоидную природу [50]. Получены данные, свидетельствующие, что Р1 — не единственный белок клеточной поверхности S. mutans, способный формировать амилоиды, поскольку колонии бактерий, лишенных данного адгезина, тем не менее индуцировали зеленое двулучепреломление при окрашивании КК [50].
Пили Mycobacterium tuberculosis — еще один пример того, какую роль, возможно, играют амилоиды внеклеточного матрикса микроорганизмов в патогенезе. Данный микроорганизм вызывает туберкулез, за год уносящий жизни почти трех миллионов человек во всем мире [2]. Пили на поверхности грамположительных M. tuberculosis нерастворимы в смеси хлороформ/метанол (2 : 1), а также в буфере, содержащем додецилсульфат натрия (ДСН), и, кроме того, взаимодействуют с амилоид-специфичным красителем КК, что свидетельствует об их амилоидной природе [2]. Мутанты, лишенные гена, кодирую- щего белок пилей M. tuberculosis, проявляли пониженную вирулентность [2]. Исследователи объясняют это тем, что пили способны связываться с белком внеклеточного матрикса ламинином, способствуя тем самым прочному закреплению микроорганизма в тканях хозяина. Таким образом, M. tuberculosis используют эти амилоидные белки для успешной колонизации организма [2]. В сыворотке пациентов, больных туберкулезом, присутствует высокий титр антител, взаимодействующих с пилями M. tuberculosis [2].
Другие грамположительные микроорганизмы, которые могут колонизовать различные органы и ткани человека, — кокки S. aureus — способны вызывать различные заболевания, от небольших инфекций кожи до бактеремии и сепсиса. Многие из этих заболеваний связаны с формированием биопленок в организме хозяина [20]. В составе биопленок S. aureus были идентифицированы внеклеточные амилоидные фибриллы, состоящие из коротких пептидов, называемых фенол-растворимыми модулинами (PSMs) [12].
У PSMs S. aureus или S. epidermidis множество функций [:lit_51,; 52, 53, 54]. PSMs в фибриллярной форме необходимы S. aureus для обеспечения устойчивости биопленок к различным диспергирующим (разрушающим биопленку) агентам, а также к механическому воздействию [12]. Авторы считают, что перспективным направлением исследований для борьбы с заболеваниями, вызванными патогенными стафилококками, является ингибирование экспорта фенол-растворимых модулинов. Поиск малых молекул — ингибиторов полимеризации амилоидов — один из путей, который может привести к разработке средств для уничтожения стафилококков на этапе формирования биопленок [49].
Пили Bacillus subtilis — важный компонент внеклеточного матрикса биопленок, формируемых бактериями на твердой поверхности и на поверхности раздела фаз между водой и воздухом [55]. Этот микроорганизм не является патогеном, однако широко распространен, встречается в почве, воде, воздухе, продуктах питания. Основная белковая субъединица пилей B. subtilis — это белок TasA [22, 56]. Фибриллы, формируемые TasA in vitro, практически не отличаются по морфологии от пилей B. subtilis [22], при этом взаимодействуют с амилоид-специфичными красителями КК и ТТ, обогащены β-слоями по данным КД-спектроскопии и деполимеризуются лишь после инкубации в присутствии муравьиной кислоты [22]. Следует отметить, что TasA был впервые идентифицирован как секретируемый белок и белок поверхности спор B. subtilis, обладающий выраженными антибактериальными свойствами [57, 58]. Антитела, используемые в диагностике нейродегенеративных заболеваний, узнают как метастабильные интермедиаты, возникающие при формировании амилоидных фибрилл, так и олигомеры TasA, что позволяет авторам говорить о возможном сходстве структуры этих двух типов олигомеров [22, 59, 60].
Амилоиды, формирующие амфипатические мембраны на поверхности клеток микроорганизмов
Гифы, споры и плодовые тела многих грибов покрыты амфипатическими (т. е. одновременно имеющими гидрофильные и гидрофобные области) родлет-слоями, которые представляют собой мозаику из параллельно уложенных фибрилл толщиной 5–12 нм [18]. Указанные амфипатические слои не растворяются при кипячении в присутствии 2 % ДСН и 1 M NaOH и диссоциируют на мономеры только при обработке муравьиной или трифторуксусной кислотами [9]. Основной и, по-видимому, единственный компонент родлет-слоев грибов — это белки гидрофобины класса I [61, 62]. Процесс полимеризации гидрофобинов наиболее эффективен в области интерфаз с высоким поверхностным натяжением (например, граница раздела жидкость–воздух), а агенты, уменьшающие поверхностное натяжение, уменьшают и скорость полимеризации гидро- фобинов in vitro [63].
Гидрофобины — это большое семейство секретируемых низкомолекулярных (7–9 кДа) белков у грибов [61]. Семейство получило свое название благодаря высокому содержанию гидрофобных аминокислотных остатков [9]. Гены, кодирующие гидрофобины, обнаружены у многих грибов. Гидрофобины класса I — типичные функциональные амилоиды, поскольку играют роль в формировании спор и плодового тела, также они важны для прикрепления к поверхности клеток организма хозяина и защиты от его иммунной системы [18, 64]. Так, при инфекции, вызываемой мицелиальными грибами Arthroderma benhamiae (дерматофиты — возбудители поверхностных микозов человека и животных), гидрофобин HypA выполняет маскирующую функцию, защищая микроорганизм от иммунной системы хозяина. Делеция гена этого гидрофобина приводит к быстрому смачиванию мицелия и конидий гриба, что вызывает повышенную активацию гранулоцитов, нейтрофилов и дендритных клеток и сопровождается увеличением в крови титра интерлейкинов IL-6, -8, -10 и фактора некроза опухоли TNF-α [65]. Развитию инфекции с участием другого мицелиального гриба Aspergillus fumigatus, приводящего к инвазивному аспергиллезу, способствует компонент родлет-слоя гидрофобин RodA, покрывающий споры патогена. В экспериментах на животных споры штамма дикого типа с удаленным с поверхности RodA или мутанта ∆laeA, содержащего на 60 % меньше этого гидрофобина, подвергались фагоцитозу макрофагами [66].
Амилоиды, входящие в состав клеточных стенок дрожжей: адгезины и глюкантрансфераза Bgl2p
В научной литературе давно известен, хотя и мало обсуждается, факт развития системного амилоидоза у мышей, инъецированных лиофилизированными клетками Candida sp. [67]. Авторы статьи особо отмечали, что отложения амилоидов могут возникать в ответ на введение экспериментальным животным казеина, альбумина, бактерий или эндотоксина E. coli [68, 69, 70, 71], однако при этом после прекращения инъекций амилоидные отложения постепенно уменьшались или исчезали [72, 73]. В случае инъецирования мышей лиофилизированными клетками Candida sp. лабораторные животные умирали от системного амилоидоза спустя весьма длительный период (через 400 дней) после последней инъекции [67]. Отдельно проведенные эксперименты показали, что введение мышам внутриклеточного содержимого Candida sp. амилоидоза не вызывало. На основании этого авторы сделали вывод, что развитие амилоидоза стимулируют компоненты клеточных стенок [67].
Биоинформатический анализ протеома дрожжей Saccharomyces cerevisiae выявил наибольшую представленность амилоидогенных белков в клеточной стенке [74]. Примером достаточно хорошо охарактеризованных белков клеточной поверхности дрожжей, обладающих амилоидными свойствами, являются белки Als (от англ. agglutinin-like sequence) [20, 21, 75]. В геноме C. albicans было обнаружено восемь генов Als, каждый из которых кодирует белок, состоящий из сигнальной последовательности, необходимой для секреции белка, трех тандемных доменов иммуноглобулин (Ig)-подобного типа, богатого треонинами домена (T-домен), разного числа гликозилированных тандемных повторов (TR) длиной 36 аминокислот, высокогликозилированного стеблевого домена и сигнальной последовательности присоединения гликозилфосфатидилинозитольного якоря, который обеспечивает ковалентное закрепление белка за глюкан клеточной стенки [76]. Ig-подобный домен обеспечивает связывание с субстратом; T-домен необходим для правильного сворачивания Ig-подобного домена и секреции; TR повышает афинность Ig-подобной области к лигандам и может обеспечивать агрегацию дрожжей, не зависящую от Ig-подобной области; благодаря наличию стеблевого домена активные области отстают от поверхности клеточной стенки на значительное расстояние [76].
Несмотря на наличие сильного гликозилирования, белки семейства Als имеют низкую растворимость, а в очищенном виде образуют амилоидные фибриллы даже при низких концентрациях [20]. Была изучена конформация N-концевых частей белков Als1p (lg-фрагмент) и Als5p (lg-T- фрагмент) в растворе [76]. Полученные данные свидетельствовали о том, что в обоих случаях β-слои были превалирующим элементом вторичной структуры анализируемого полипептида [76]. Показано также, что Als5p, Als1p и Als3p содержат в своем составе высококонсервативный потенциально амилоидогенный участок (ПАУ) в Т-домене [20].
Интересно отметить, что ПАУ были обнаружены не только в аминокислотных последовательностях Als-белков, но и в аминокислотных последовательностях дрожжевых адгезинов из других семейств [75]. Пептиды, содержавшие эти ПАУ, формировали фибриллы, взаимодействовавшие с амилоид-специфичными красителями, и согласно данным КД-спектроскопии обладали обогащен- ной β-слоями вторичной структурой [75]. Вероятно, амилоидообразование может быть весьма широко распространенным явлением [75].
Оппортунистический дрожжевой патоген Candida albicans формирует биопленки, облегчающие колонизацию тканей организма хозяина и делающие клетки C. albicans чрезвычайно устойчивыми к антимикробным препаратам [77, 78]. Важную роль в патогенезе и формировании биопленок играют описанные выше Als-адгезины, наряду с множеством других адгезинов, продуцируемых C. albicans [78, 79]. Некоторые Als-адгезины формируют амилоидные структуры [20, 21, 75], что, вероятно, способствует взаимодействию клеток C. albicans с белками внеклеточного матрикса (фибронектином, ламинином, коллагеном IV типа) и другими пептидными лигандами млекопитающих, клетками других видов дрожжей, клетками бактерий, а также автоагрегации клеток C. albicans [76, 78]. Способность клеток Candida sp. удерживаться за счет поверхностных адгезинов на слизистых поверхностях различных органов и синтетических материалах является важным фактором патогенности этих грибов и содействует развитию инфекции. Наиболее выражена данная способность у дрожжей C. albicans [80, 81].
Глюкантрансфераза Вgl2p — еще один белок клеточной стенки дрожжей с наличием амилоидных свойств. Это небольшой (31,5–34 кДа в зависимости от вида дрожжей), консервативный, мажорный нековалентно закрепленный белок, присутствие которого в клеточной стенке показано для многих видов дрожжей, таких как S. cerevisiae, C. albicans, A. fumigatus [82, 83, 84]. Bgl2p из S. cerevisiae проявляет высокую гомологию по отношению к Bgl2p из C. albicans. Антитела против Bgl2p S. cerevisiae реагируют с Bgl2p C. albicans [82, 85]. Bgl2p устойчив к гидролизу трипсином и протеиназой К в составе клеточной стенки, а также не может быть экстрагирован из нее с помощью 1 % раствора ДСН в воде при 37 °C, в отличие от всех других нековалентно закрепленных в полисахаридном каркасе белков клеточной стенки [86].
Bgl2p, выделенный из клеточной стенки S. cerevisiae, способен образовывать структуры, которые имеют фибриллярную морфологию [86, 87], отчетливо выявляемую при микроскопических исследованиях (рисунок). Выделенный из клеточной стенки белок Bgl2p индуцировал специфическую флуоресценцию ТТ и демонстрировал спектр кругового дихроизма, характерный для белка, обогащенного β-структурой [86, 88], что тоже свидетельствовало об амилоидной природе формируемых Bgl2p структур. Изучали также рН-зависимость способности Bgl2p фибриллизоваться с использованием как выделенного белка, так и модели на основе синтетических пептидов, соответствующих по последовательности предсказанным биоинформатически потенциально амилоидогенным участкам Bg2p [87]. Было показано, что при нейтральных и слабокислых значениях pH-среды выделенный из клеточной стенки Bgl2p фибриллизуется, тогда как уже при слабощелочных значениях рН данный белок теряет способность формировать амилоидные фибриллы [87]. Механизм амилоидообразования Bgl2p в клеточной стенке, равно как и физиологическую роль этого процесса для функционирования дрожжей, еще только предстоит выяснить [89].
Bgl2p, вероятно, играет определяющую роль в вирулентности патогенных видов дрожжей, поскольку делеция гена BGL2 снижает способность этих микроорганизмов к заражению [82]. Дженг и соавт. обнаружили, что Bgl2p C. albicans также выполняет роль адгезина, обеспечивающего связь клеток с иммобилизованными компонентами слюны [85]. Было показано, что антитела к Bgl2p C. albicans являются диагностическим биомаркером системного кандидоза, а их высокий уровень коррелирует со снижением вероятности летального исхода, что связано, по-видимому, с защитной ролью данных антител [90].
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Описывая амилоидные белки поверхности микроорганизмов, мы не рассматривали статьи, посвященные таким амилоидам, как чаплины, микроцины и харпины, поскольку к настоящему моменту их роль в патогенезе человека и животных либо не выявлена, либо малоизучена. Тем не менее исследования структуры и механизмов формирования этих и других амилоидов, активно ведущиеся в ряде крупных научных центров и лабораторий как у нас в стране, так и за рубежом, позволяют ожидать новых важных результатов в данной области исследований.
Мы полагаем, что необходимо уделять внимание анализу возможной роли амилоидов и других компонентов поверхности клеток микроорганизмов при изучении развития заболеваний с неясной этиологией. У многих высших эукариот, и в том числе человека, микроорганизмы присутствуют в большом количестве. Можно сказать, что для значительного числа животных микроорганизмы являются их неотъемлемой составляющей. Количество клеток микроорганизмов может значительно превышать количество клеток организма хозяина [1]. Компоненты клеточной поверхности микроорганизмов, включая амилоидные белки, находятся в постоянном контакте с клетками и жидкостями организма хозяина. Недальновидно недооценивать потенциальную роль этих молекул, локализованных на поверхности микроорганизмов как про-, так и эукариотического происхождения, в метаболизме животных и человека, и в том числе в процессах, ведущих к их заболеванию.